王奕海 謝露

摘要： 目的：探討PD98059對缺糖缺氧再灌注損傷神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）細(xì)胞的保護(hù)作用 方法：將SH-SY5Y細(xì)胞隨機(jī)分為正常組（Control組）、DMSO組、缺糖缺氧再灌注性損傷組（OGD/R組）、PD98059低劑量組（PD98059-L）、PD98059中劑量組（PD98059-M）、PD98059高劑量組（PD98059-H），DMSO組給予0.1%DMSO，PD98059-L、PD98059-M、PD98059-H分別給予10、30、50μmol/L的PD98059，24 h后OGD/R組、PD-L組、PD-M、PD-H組進(jìn)行缺糖缺氧處理4 h，隨后復(fù)氧24 h。采用CCK-8法測算細(xì)胞存活率; Western blotting法檢測細(xì)胞中Caspase-3蛋白。結(jié)果? PD98059-L組、PD98059-M組、PD98059-H組細(xì)胞存活率高于OGD/R組（P均<0.05），逐漸增加。OGD/R組Caspase3相對表達(dá)量高于Control組、DMSO組，PD98059-L組、PD98059-M組、PD98059-H組Caspase3相對表達(dá)量低于OGD/R組（P均<0.05）。Caspase3相對表達(dá)量逐漸降低，兩兩比較，P均<0.05。結(jié)論? PD98059可保護(hù)缺糖缺氧再灌注損傷的SY-SY5Y細(xì)胞，提高細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞凋亡率。

關(guān)鍵詞：PD98059;缺糖缺氧再灌注損傷;SH-SY5Y細(xì)胞

【中圖分類號】R73?? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A??? 【文章編號】2107-2306（2020）02-311-01

腦卒中是人類神經(jīng)系統(tǒng)殘疾的主要原因，發(fā)病人群已經(jīng)出現(xiàn)年輕化趨勢，嚴(yán)重影響人民的身體健康和生活質(zhì)量，給患者和社會照成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。腦卒中治療原則是恢復(fù)缺血區(qū)域的血液供應(yīng)。 目前對其急性治療的治療方法僅依靠通過藥理溶栓和/或機(jī)械血栓切除術(shù)恢復(fù)血流^[1]。 然而，它可以加重缺血后腦組織的損傷。 因此，迫切需要開發(fā)出療效高，副作用少的新型藥物來治療中風(fēng)和保護(hù)神經(jīng)元^[2]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）為絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成員之一，可被氧自由基激活，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡^[3]。ERK抑制劑PD98059則可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受細(xì)胞氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡^[4]。本實(shí)驗(yàn)以神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y為研究對象，在體外構(gòu)建OGD/R模型以模擬腦缺血缺氧再灌性損傷模型，觀察PD98059對OGD/R的SH-SY5Y細(xì)胞存活率、凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)的影響。

1? 材料與方法

1. 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 SH-SY5Y細(xì)胞株購自武漢大學(xué)細(xì)胞庫。MEM培養(yǎng)基、胎牛血清和L-谷氨酰胺購自Gibco公司。CCK-8、DMSO為美國Sigma公司產(chǎn)品。PD98059購自美國Selleck公司。一抗（Caspase-3 Rabbit mAb）購自Cell Signaling Technology公司。酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2? OGD處理時(shí)間篩選? SH-SY5Y細(xì)胞在鏡下觀察至70%融合時(shí)，制成細(xì)胞懸液，種植于96孔板內(nèi)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后，加入無糖DMEM， 將培養(yǎng)板至于三氣培養(yǎng)箱（94%N₂、5%CO₂、1%O₂）培養(yǎng)2.0、4.0、6.0 h。處理完后換成完全培養(yǎng)基，在正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液后培養(yǎng)3 h，用酶標(biāo)儀檢測OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。OGD處理2.0、4.0、6.0 h后細(xì)胞存活率分別為89.03%±3.99%、55.65%±1.95%、34.54%±2.78%。選取細(xì)胞存活率在50%～60%的作用時(shí)間段即OGD 4h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件^[5]。

1.3? 細(xì)胞分組、模型制作及PD98059干預(yù)? SH-SY5Y細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含5%胎牛血清的高糖MEM中，于37 ℃、5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞重懸鋪板，取對數(shù)生長期細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。取良好的SH-SY5Y細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對照組（Control組）、DMSO組（DMSO組）、模型組（OGD/R組）、PD98059低劑量組（PD98059-L組）、PD98059中劑量組（PD98059-M組）、PD98059高劑量組（PD98059-H組）。Control組和OGD/R組加入完全培養(yǎng)基，DMSO組加入含0.1% DMSO的培養(yǎng)基，PD98059-L組、PD98059-M組、PD98059-H組分別加入終濃度為10、20、30 μmol/L的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，Control組和DMSO組加入正常培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)。OGD/R組、PD98059-L組、PD98059-M組、PD98059-H組換成無糖培養(yǎng)基，OGD處理2 h后，換成正常培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4? 細(xì)胞存活率測量 按照CCK-8檢測試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞存活率。

1.5? Caspase3蛋白檢測 收集各組細(xì)胞，按照蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒提取蛋白并檢測蛋白濃度。每個(gè)樣本加樣量為100 μg;用Western blotting法檢測Caspase3蛋白相對表達(dá)量。

1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，各組數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間采用單因素方差分析（ANOVA）， 以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組存活率比較? Control組、DMSO組、OGD/R組、PD98059-L組、PD98059-M組、PD98059-H組細(xì)胞存活率分別為100%、94.65%±4.62%、54.25%±3.57%、64.72%±4.63%、76.28%±4.62%、88.72%±6.91%。PD98059-L組、PD98059-M組、PD98059-H組細(xì)胞存活率逐漸增加，兩兩相比，P均<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2各組細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)情況

Control組、DMSO組、OGD/R組、PD98059-L組、PD98059-M組、PD98059-H組細(xì)胞中Caspase3表達(dá)量分別為0.20±0.21、0.21±0.02、0.37±0.06、0.31±0.05、0.26±0.06、0.22±0.05。OGD/R組Caspase3相對表達(dá)量高于Control組、DMSO組（P均<0.05）;PD98059-L組、PD98059-M組、PD98059-H組Caspase3表達(dá)量低于OGD/R組，且表達(dá)量降低，兩兩比較，P均<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

腦卒中具有高病死率和高致殘率，且逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢。本研究初步探明了ERK抑制劑PD98059對SH-SY5Y細(xì)胞缺糖缺氧再灌注性損傷后的凋亡具有明顯的抗凋亡作用。具體機(jī)制還有待于更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索。

參考文獻(xiàn)：

[1] Mar Martinez-Vila E， Irimia P： Challenges of neuroprotection and neurorestoration in ischemic stroke treatment. Cerebrovasc Dis 2018;20：148-158.

[2] Jaffer H， Morris VB， Stewart D， Labhasetwar V： Advances in stroke therapy. Drug Deliv Transl Res 2019;1：409-419.

[3] Lu TH， Tseng TJ， Su CC， et al. Arsenic induces reactive oxygen species-caused neuronal cell apoptosis through JNK/ERK-mediated mitochondria-dependent and GRP 78/CHOP-regulated pathways[J]. Toxicol Lett， 2014，224（1）：130-140.