王 道，施曉波，陳建林

(中南大學湘雅二醫(yī)院婦產(chǎn)科， 長沙 410011)

人髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)屬于調節(jié)先天免疫的銜接蛋白，在人體內病毒和細菌感染的免疫應答中發(fā)揮重要的功能[1-4]。Lord等[5]在髓樣前體的鼠骨髓中分析發(fā)現(xiàn)了MyD88基因。以往研究發(fā)現(xiàn)其在免疫細胞如單核細胞系、胸腺細胞系、T 淋巴細胞系、B淋巴細胞系、Th1細胞系和Th2細胞系中表達，說明人MyD88蛋白具有廣泛分布性[6-8]。而且，大量研究集中關注人MyD88在炎癥、腫瘤等領域發(fā)揮的作用[9-12]。Chen等[13]發(fā)現(xiàn)MiR-146a通過TLR4/MyD88信號轉導途徑能夠減輕急性痛風性關節(jié)炎。Zhu等[14]和Sewastianik等[15]發(fā)現(xiàn)人MyD88影響了癌細胞的增殖、侵襲和遷移。Kfoury等[16,17]報道人MyD88可能具備雙重功能，既發(fā)揮促腫瘤作用，也可以通過調節(jié)免疫反應發(fā)揮抗腫瘤作用。本文對人MyD88結構模型進行相關生物信息學分析，并闡述其功能，為疾病治療等提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人(Q99836)、大鼠(Q6Y1S1)、小鼠(P22366)、雞(A5HNF6)、豬(A0A140TAK4)的 MyD88 蛋白序列都從UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)獲取，人MyD88基因的核酸序列Accession(NC_000003.12)從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取。

1.2 方法

對人MyD88使用多種生物信息數(shù)據(jù)庫進行結構和功能分析,具體見表1。

表1 預測分析人MyD88結構和功能的生物信息數(shù)據(jù)庫Tab.1 Important databases for predictive analysis of human MyD88 structure and function

2 結果與分析

2.1 人MyD88基因的開放閱讀框和染色體定位

人MyD88基因全長為5 670 bp，位置為38 138 006～38 143 675，共有649個開放閱讀框，如圖1a所示。Ensemble(http://asia.ensembl.org/)顯示該基因位于3號染色體上(3p22.2)(圖1b)。

圖1 人MyD88基因的開放閱讀框(a)和基因的染色體定位信息(b)Fig.1 The open reading frame (a) and chromosome location of human MyD88 gene (b)

2.2 人MyD88蛋白的理化性質分析

使用ProtParam預測分析了人MyD88蛋白的理化性質，發(fā)現(xiàn)該蛋白由296個氨基酸殘基組成，含有36個帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)和38個帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)；總分子式為C1 471H2 361N403O437S16，總原子數(shù)為4 691，分子質量為33 233.36；半衰期是30 h；等電點是5.89；消光系數(shù)是38 430；疏水值是92.30，平均親水性是-0.174；不穩(wěn)定系數(shù)是45.58，人MyD88為不穩(wěn)定蛋白質。

2.3 人 MyD88 蛋白物種同源性分析

把人(Homosapiens)(Q99836)MyD88 的氨基酸序列與大鼠(Rattusnorvegicus) (Q6Y1S1)、 小鼠(Musmusculus)(P22366)、雞(Gallusgallus)(A5HNF6)和豬(Susscrofa)(A0A140TAK4)的氨基酸序列進行多序列比對和構建進化樹。比對結果如圖2a所示，具有相似性高的氨基酸是從第145位至第295位，5個物種的氨基酸序列相似性較高，同源性較高。進化樹結果如圖2b所示，人與豬、小鼠、大鼠進化距離較近，但是與雞相距較遠，說明人MyD88蛋白在哺乳動物之間的保守性較高，可推測其有重要的功能。

圖2 人MyD88氨基酸序列比對(a)和進化樹分析(b)Fig.2 Sequence alignment analysis (a) of human MyD88 and phylogenetic tree (b)

2.4 人MyD88蛋白在正常組織的表達分布

通過GEDS在線分析數(shù)據(jù)庫(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GEDS/)分析，結果顯示，人MyD88蛋白在血液中表達量最高，其次是脾臟和肺，心臟、腦的含量處于較低水平，在肌肉中的表達量是最低的，可推測其在血液中的表達量對發(fā)揮生物學作用是至關重要的(圖3)。

2.5 人MyD88蛋白的信號肽和亞細胞定位預測分析

利用SignalP 4.1 Server網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP- 4.1/)進行信號肽分析，Cut-off default=0.450。結果顯示，C-Max Position、Y-Max Position、S-Max Position 分別為 46、46、44，其中C-Max Value、Y-Max Value、S-Max Value 分別為0.185、0.182、0.500，S-mean(1～ 45)和D (1～ 45)分別為0.182、0.182，得分值Score<0.450，提示人MyD88不存在信號肽，屬于非分泌性蛋白(圖4)。采用Genecards網(wǎng)站(https://www.genecards.org/)進行人MyD88蛋白的亞細胞定位分析，根據(jù)Confidence(0～5)對應顏色的深淺，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要分布在細胞核、細胞質和囊泡中，而且在質膜、線粒體、溶酶體中也有分布，表明人MyD88參與了維持細胞正常形態(tài)和骨架結構的過程(圖5)。

2.6 人MyD88蛋白的磷酸化位點和蘇木化位點預測分析

提交人MyD88蛋白的氨基酸序列到NetPhosK 2.0和SUMOPLOT進行軟件預測分析，結果顯示,有25個磷酸化位點，其中磷酸化絲氨酸位點15個(氨基酸位置分別為 15、16、18、19、34、85、108、137、194、224、230、242、244、266、294位)，磷酸化蘇氨酸位點6個(氨基酸位置分別為 17、66、149、202、237、272位)，磷酸化酪氨酸位點4個(氨基酸位置分別為 58、116、227、276位)(圖6)。人MyD88蛋白上存在一些容易發(fā)生蘇木化修飾的位點，其中K261位點發(fā)生概率最高(Score=0.80>0.50)，K262位點概率較小(Score=0.13<0.50)(圖7)。結果表明，人MyD88可能發(fā)生絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸激酶磷酸化以及K261位點的蘇木化修飾發(fā)揮調控機制。

圖3 人MyD88在正常組織的表達量分析Fig.3 Analysis of normal tissues expression of human MyD88

圖4 人MyD88信號肽預測Fig.4 Signal peptide prediction of human MyD88

圖5 人MyD88亞細胞定位預測Fig.5 Subcellular location prediction of human MyD88

圖6 人MyD88蛋白磷酸化位點預測Fig.6 Phosphorylation sites prediction of human MyD88

圖7 人MyD88蛋白SUMO化位點預測Fig.7 Sumolation sites prediction of human MyD88

2.7 人MyD88蛋白質高級結構預測分析

運用Jpred 4.0蛋白二級結構在線分析網(wǎng)站(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/)進行預測，發(fā)現(xiàn)人MyD88蛋白存在145個α-螺旋，其占55.07%(163/296),存在 30個β-折疊，其占38.18%(113/296)，剩余的是無規(guī)則卷曲。說明該蛋白是以α螺旋為主，具有超過50%氨基酸的有序空間構象(圖8)。

Swiss-Model網(wǎng)站(https://swissmodel.expasy.org/)預測人MyD88三級結構存在2種模型。模型A(圖9a)和模型B(圖 9b)對應的模板都不同，其主要重疊分別在第146～296 位氨基酸、第26～117 位氨基酸，序列等同度分別為62%、59%。而且圖9c峰圖波形比圖9d峰圖穩(wěn)定，可推測模型A更加符合人MyD88蛋白的三級真實結構。進一步對模型A的可靠性進行分析，如圖10拉曼圖表明，除160位、188位和269位的精氨酸(Arg)，150位和199位的亮氨酸(Leu) 以及244位的絲氨酸(Ser)和202位的蘇氨酸(Thr)以外, 大于90%的氨基酸位于紅色核心區(qū)域，其中黃和紅色區(qū)域形成二面角合理, 有較好的三級構象空間，深入證明了模型A的三級結構的可靠性。

圖8 人類MyD88二級蛋白結構分析Fig.8 Secondary protein structure analysis of human MyD88 H:α-螺旋；E:β-折疊H:α-helix; E:β-sheet

圖9 人類MyD88的三級蛋白結構構象圖Fig.9 Tertiary protein structure model prediction of human MyD88(a)人類MyD88三級結構模型A； (b)人類MyD88三級結構模型B； (c)與模型A的模板相似性峰圖； (d)與模型B的模板相似性峰圖(a)The tertiary structure model A of human MyD88; (b)The tertiary structure model B of human MyD88; (c)Peak map of template similarity to the model A; (d)Peak map of template similarity to the model B

圖10 人類MyD88模型A的拉曼構象圖分析Fig.10 Ramachandran map analysis model A of human MyD88

2.8 人MyD88蛋白String分析和GO分析

通過 String 數(shù)據(jù)庫分析預測與人MyD88發(fā)生相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)與人MyD88 相互作用前10的蛋白質為IL1R1、IRAK4、IRAK1、TRAF6、IRAK2、TLR3、IRAK3、IRF7、TLR7、MAP3K7，具體如圖11所示。其中IL1R1、IRAK1、IRAK4、IRF7 等蛋白在先天免疫應答中起關鍵作用，TLR3和TLR7蛋白屬于先天和適應性免疫的關鍵組成部分，表明該蛋白在先天性免疫反應中起核心作用。

GO(gene ontoloty)注釋分析的細胞組分結果提示:人MyD88蛋白主要定位在核內體，在胞質內大量分布；分子功能結果表明，人MyD88蛋白屬于Toll樣受體(TIR)，具有TIR結構域，能夠與白介素-1受體和凋亡受體等其他蛋白受體結合且形成二聚體結構；生物學過程表明，人MyD88 參與調控趨化因子的生物合成、誘導機體抵抗、調節(jié)機體炎癥反應和細胞凋亡等過程，分析結果和人 MyD88 互相作用蛋白參與免疫反應相一致(圖12)。

圖11 預測與人類MyD88發(fā)生相互作用的蛋白網(wǎng)絡Fig.11 Protein network interacted with human MyD88(a)相互作用蛋白網(wǎng)絡圖；(b)蛋白相互作用連線說明(a)Interacting protein prediction;(b)Instructions with protein interaction lines

圖12 人類MyD88的GO注釋分析Fig.12 GO analysis of human MyD88綠色表示細胞組分；紅色表示分子功能；黃色表示生物學過程Green means cellular component;Red means molecular function;Orange means biological processes

3 討論

人MyD88是由296個氨基酸構成，以α-螺旋為主的二級結構蛋白,本文結果表明，其在血液、脾臟等淋巴器官中存在高度表達，與相關文獻報道的其在單核細胞、T、B、NK和樹突細胞表達是相符的[18,19]。以往研究也證實，由于所有TLR/IL-1R都能與人MyD88發(fā)生相互作用，病原體和宿主的刺激對TLR/IL-R的異常激活，可以產(chǎn)生一系列炎癥細胞因子和其他介質[20]。當前，人MyD88在腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中的作用也受到人們的日益關注。Wu等[21]在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)人MyD88表達水平與乳腺癌細胞轉移程度呈正相關。我們推斷檢測人MyD88在腫瘤中的表達可以預測人類癌癥，如脾臟、淋巴、結腸腫瘤等。最近，Wang等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)人MyD88具有雙重功能，誘導腫瘤細胞的侵襲和自我更新，發(fā)揮促腫瘤作用以及維持腫瘤的抗腫瘤作用，推測人MyD88可能參與癌癥相關細胞信號通路以外的其它機制。

為了探究這種可能的機制，我們首先對人MyD88基因進行分析，結構分析表明，該基因位于3號染色體上，基因全長為5 670 bp，同源比對結果表明人、豬、小鼠和大鼠均具有較高的相似性。這提示我們在進行動物模型研究中需選取同源性較高的部分序列，研究其在進化中保留的重要生物學作用。而且，人MyD88蛋白是一個不穩(wěn)定蛋白，不含信號肽，亞細胞定位大量存在于細胞核和細胞質中，在線粒體和溶酶體內也有一些分布，這些都揭示其能夠在胞內組裝折疊成相應結構并結合相應蛋白質，隨后參與線粒體、細胞核、過氧化物酶體等免疫應激反應，與Balaji等[23,24]報道其可能定位于核內并行使較多功能的特點相一致。我們還推測，人MyD88存在25個磷酸化位點和2個蘇木化位點，這與Wu等[25]運用磷酸化蛋白質組學證實的磷酸位點和 Lanfranca等[26]證實的E3泛素連接酶能蘇木化修飾且阻斷人MyD88下游的信號傳導同時能降低其表達的報道是一致的。

此外，本文預測的人MyD88和IRAK、TLR等發(fā)生相互作用也在相關文獻中有報道[27,28]。有趣的是，Wang等[29]證實人MyD88與caspase3介導的凋亡途徑有關。Huang等[30]發(fā)現(xiàn) TLR4-MyD88-JNK信號通路促進大鼠的炎癥反應，從而引起神經(jīng)元細胞凋亡。Saxena等[31]發(fā)現(xiàn)通過抑制人MyD88阻斷IL-1受體信號，可以減少對血管損傷的新內膜形成，降低平滑肌細胞的過度增殖。

綜上所述，生物信息學是一種新的研究蛋白質結構和功能預測的重要手段，能夠進一步挖掘基因的潛在功能。后續(xù)我們還需進行人MyD88蛋白表達及功能驗證試驗來判定預測結果的精準性，為其今后成為潛在的靶分子用于疾病診斷和治療奠定基礎。