謝芝玲，徐佳瑩，潘 登，劉 峰，陳 燕，楊煥勝，印遇龍,4，夏立秋，張友明,，涂 強*

(1.湖南師范大學生命科學學院， 微生物分子生物學湖南省重點實驗室， 淡水魚類發(fā)育生物學國家重點實驗室， 長沙 410081； 2.亥姆霍茲抗感染國際實驗室， 山東大學亥姆霍茲生物技術(shù)研究所， 微生物技術(shù)國家重點實驗室， 青島 266237； 3.山東億安生物工程有限公司， 濟南 250100； 4.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所， 畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國家工程實驗室， 亞熱帶地區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室， 湖南省健康畜禽工程研究中心， 農(nóng)業(yè)部中南部動物營養(yǎng)與飼料科學科學觀測站， 長沙 410125)

水產(chǎn)養(yǎng)殖是農(nóng)副業(yè)生產(chǎn)的重要組成部分[1,2]，其大多采用高密度養(yǎng)殖的方式實施。在水產(chǎn)養(yǎng)殖的過程中，飼料殘渣、水生動物的排泄物以及動植物尸體會不斷地在養(yǎng)殖水體中堆積，在缺氧的條件下，經(jīng)淤泥中的微生物發(fā)酵分解產(chǎn)生氨氮、硫化物、有機酸和亞硝酸鹽等多種有害物質(zhì)，引起水體嚴重污染[3,4]。同時，污染的水體環(huán)境使得原有的生態(tài)系統(tǒng)平衡被打破[5]，水體中的浮游植物以及水生植物無法正常生長，給各種有害病源微生物的繁殖和傳播創(chuàng)造了有利條件，導致水生產(chǎn)品的患病率增高，嚴重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益和健康發(fā)展。

以往經(jīng)常使用各類化學藥物以及抗生素來抑制病原微生物的生長繁殖[6]。然而，抗生素的大量使用容易引起內(nèi)源性感染、耐藥性菌株的產(chǎn)生、水產(chǎn)品免疫力低下和水產(chǎn)品以及水體環(huán)境中抗生素殘留[7]等問題，危及食品衛(wèi)生安全甚至人類健康。目前，許多國家和地區(qū)都已經(jīng)明令禁止在飼喂端使用促生長類的抗生素，所以急需要一種綠色健康的技術(shù)來推動水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

針對近年來對蝦養(yǎng)殖低產(chǎn)、病多的難題，有效的微生物菌劑在這樣的市場需求下應運而生[8]。大量試驗證明，微生物菌劑是抗生素的最佳替代品之一，其具有安全可靠、無毒害作用和不污染環(huán)境[9-11]等優(yōu)點。為此，本研究以長毛對蝦(Penaeuspenicillatus)為研究對象，監(jiān)測并比較了添加復合微生物菌劑后，對蝦的生長情況和養(yǎng)殖環(huán)境中相關(guān)指標的變化情況，以探討微生物制劑對于對蝦養(yǎng)殖及養(yǎng)殖水體改良的影響情況及使用方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

長毛對蝦購自廈門水產(chǎn)學院海水育苗場，復合微生物菌劑由山東億安生物工程有限公司提供，原料為復合微生物菌粉25%、低聚異麥芽糖4.85%、菜籽餅粉70%、食用香精0.15%，活菌數(shù)為1010CFU/g。其中復合微生物菌粉為酵母菌[產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)、釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)]，乳酸菌[嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、德氏乳酸桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)]，芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和光合菌(photosynthetic bacteria)的組合，其質(zhì)量比為1∶1∶1∶0.5?；A飼料原料為低聚異麥芽糖6.22%，菜籽粉餅93.33%，食用香精0.2%。

試驗設備主要有電子磅秤AWH(上海英展公司)、分析天平型號FA1004N(上海精密儀器儀表有限公司)、分光光度計型號721G(上海儀電分析儀器有限公司)、pH計PHS-3C(上海儀電分析儀器有限公司)和水質(zhì)檢測儀XZ-0178(青島明博環(huán)?？萍加邢薰?。

1.2 試驗設計與方法

試驗為單因子試驗，試驗場地位于山東省淡水水產(chǎn)研究所。將平均體長為0.5 cm的396尾對蝦隨機分成4個組，分別為對照組組1，試驗組組2、組3和組4，每個組設定3個平行，每個平行33尾，分別養(yǎng)殖于1.2 m×1.0 m×0.6 m的室內(nèi)水泥池，進行為期33 d的飼養(yǎng)(2018年5月23日至2018年6月24日)。對照組組1投喂無復合微生物菌劑的基礎飼料；組2、組3和組4為試驗組，投喂有微生物菌劑添加的飼料，微生物菌劑分別占飼料質(zhì)量的1.0%、1.5%和2.0%。每天投餌2次，分別在上午7∶00和下午18∶00。

在投放蝦苗前15 d，每畝蝦池用25 kg經(jīng)過0.5%的億安奇樂發(fā)酵的復合菌液水均勻噴灑蝦池，凈化養(yǎng)殖環(huán)境，為不同組的對蝦提供相同的初始養(yǎng)殖環(huán)境。

1.3 樣品采集

在測量日的當天7∶30至8∶00，在距離蝦池岸0.6 m、水深0～10 cm處的4個采樣點用采泥器取樣，樣品裝進高溫高壓滅菌后的塑料管內(nèi)密封冷凍保存。在測量日的當天7∶30至8∶00，用采水器在距離蝦池岸0.6 m、水深20～30 cm處的4個采樣點采取水樣，通過微孔濾膜抽真空過濾，濾液密封保存。

1.4 檢測指標與方法

生產(chǎn)性能測定：在測量日當天，從4個組中分別隨機抽取30尾(各平行組10尾)對蝦進行測量、稱重，分別計算4個組對蝦的健康及死亡情況。

水質(zhì)指標測定：pH值用pH計現(xiàn)場測定，溶解氧(dissolved oxygen,DO)用水質(zhì)檢測儀現(xiàn)場測定，水質(zhì)分析按照GB17378.4-2007方案進行[12]，氨氮(NH4-N)含量測定采用次溴酸鹽氧化法，亞硝酸氮(NO2-N)含量采用鹽酸萘乙二胺分光光度法測定，硝酸氮(NO3-N)含量測定采用鋅-鎘還原法。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所獲數(shù)據(jù)經(jīng)EXCEL表格初步處理作圖，采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，檢驗結(jié)果平均數(shù)的顯著性，P<0.050表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物菌劑對長毛對蝦的生產(chǎn)性能的影響

從表1可以看出，隨著試驗的進行，幼蝦的體長和體重與養(yǎng)殖時間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。使用了微生物菌劑組(組2、組3和組4)的生長速度和成活率均明顯高于對照組(組1)(P<0.050)，其中體重增長率比對照組(組1)分別提升了106.3%、131.2%和175.0%，成活率比對照組(組1)分別提升了40.9%、43.4%和43.8%。上述結(jié)果表明，噴灑在飼料上的微生物菌劑對對蝦有明顯的促生長作用，而且能明顯地提升其存活率。

表1 試驗33 d后各組的體長、體重、增重率和成活率Tab.1 The body length, weight, weight gain rate and survival rate of each group after 33 d incubation

注：表中同列數(shù)據(jù)肩標不同表示差異顯著(P<0.050)

Note:There was significant difference in shoulder mark of the same column of data in the table (P<0.050)

2.2 微生物菌劑對飼養(yǎng)池底泥中弧菌數(shù)量的影響

在對蝦的培育過程中，弧菌(Vibriospp.)對其危害較大[13-15]。當環(huán)境條件惡化，對蝦抵抗力降低時，弧菌就會乘虛而入，引起對蝦的病變，使其生長緩慢乃至死亡。從圖1可以看出，對照組(組1)的弧菌個數(shù)是使用了微生物菌劑的試驗組(組2、組3和組4)中的弧菌個數(shù)的14倍。在養(yǎng)殖前期(2018年5月23日)，四個組飼養(yǎng)池中，1 g池底干泥中弧菌的數(shù)量無顯著差異(P>0.050)。在養(yǎng)殖初期(前10 d)，對照組(組1)的弧菌數(shù)呈上升趨勢，而使用了微生物菌劑的試驗組(組2、組3和組4)弧菌個數(shù)則緩慢減少(P=0.000)。以上結(jié)果表明，使用微生物菌劑能有效改善養(yǎng)殖水體環(huán)境，抑制有害菌體的生長。

圖1 試驗期間各組飼養(yǎng)池中1 g池底干泥中弧菌的數(shù)量動態(tài)變化Fig.1 Dynamics of Vibrios during the 33 d incubation

2.3 微生物菌劑對養(yǎng)殖水體中pH和DO含量的影響

水中的酸堿度可直接影響對蝦的新陳代謝，在對蝦的生長過程中起著至關(guān)重要的作用。將各數(shù)據(jù)進行重復測量的方差分析，不同時間的pH值具有顯著差異性(P<0.050)。如圖2a所示，隨著養(yǎng)殖時間的增長，使用了微生物菌劑的試驗組(組2、組3和組4)的pH值逐漸降低，組4最低值達到7.01，對照組下降曲線則較為平緩。組1與組4在第0天時數(shù)據(jù)不具有顯著差異性(P>0.050)，第10天以后出現(xiàn)顯著差異(P<0.050)，這說明含2.0%的微生物菌劑的飼料可降低pH值。以上結(jié)果表明，使用微生物菌劑有助于控制養(yǎng)殖水池的pH值，以達到養(yǎng)殖水體環(huán)境質(zhì)量的要求。

養(yǎng)殖水體中的溶解氧是對蝦養(yǎng)殖過程中影響生長的重要因素，充足的溶解氧有助于對蝦生長。在四次采樣數(shù)據(jù)中，不同時間的溶解氧具有顯著差異(F=191.959,P=0.000)。從圖2b可以看出，4個組的溶氧量在33 d時間內(nèi)呈下降趨勢，使用了微生物菌劑的試驗組(組2、組3和組4)水中DO含量比對照組(組1)高，養(yǎng)殖期間(2018年5月23日至2018年6月24日)DO含量波動范圍在5.46～6.67 mg/L之間，對照組(組1)養(yǎng)殖水池中DO含量波動范圍在4.39～6.45 mg/L之間。從各時間點看，除了第0天4個組的數(shù)據(jù)和第10天組3、組4的數(shù)據(jù)不具有顯著差異外(P>0.050)，其他時間點均以對照組的DO含量最低(P<0.050)。上述結(jié)果表明，使用微生物菌劑，能增加水體的DO，保證了對蝦的正常生長。

圖2 試驗期間各組養(yǎng)殖水體中pH和DO含量的動態(tài)變化Fig.2 Dynamics of pH and DO content in aquaculture water during the 33 d incubation(a)試驗期間各組養(yǎng)殖水體中pH含量的動態(tài)變化;(b)試驗期間各組養(yǎng)殖水體中DO含量的動態(tài)變化(a)Dynamics of pH content in aquaculture water during the 33 d incubation;(b)Dynamics of DO content in aquaculture water during the 33 d incubation

2.4 微生物菌劑對養(yǎng)殖水體中氮素形態(tài)的影響

氨氮(NH4-N)是養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，濃度過高會制約對蝦的養(yǎng)殖和造成水體富營養(yǎng)化等環(huán)境污染[16]。如圖3a所示：在養(yǎng)殖初期(前10 d)，4個養(yǎng)殖水池的NH4-N質(zhì)量濃度都呈上升趨勢，隨著養(yǎng)殖時間的增加，使用微生物菌劑的試驗組(組2、組3和組4)中的NH4-N質(zhì)量濃度逐漸減少，而對照組(組1)的NH4-N質(zhì)量濃度繼續(xù)呈現(xiàn)上升趨勢(F=250.633，P=0.000)；在養(yǎng)殖前期(2018年5月23日)，4個養(yǎng)殖水池的NH4-N質(zhì)量濃度無顯著差異(P>0.050)，其他時間點均以對照組的NH4-N質(zhì)量濃度最高(P<0.050)；到養(yǎng)殖后期，使用微生物菌劑的試驗組(組2、組3和組4)中的NH4-N質(zhì)量濃度均低于0.070 mg/L，而對照組(組1)的NH4-N質(zhì)量濃度已達0.162 mg/L。

圖3 試驗期間各組養(yǎng)殖水體中NH4-N、NO2-N和NO3-N的動態(tài)變化Fig.3 Dynamics of NH4-N, NO2-N and NO3-N in aquaculture water during the 33 d incubation(a)試驗期間各組養(yǎng)殖水體中NH4-N的動態(tài)變化;(b)試驗期間各組養(yǎng)殖水體中NO2-N的動態(tài)變化;(c)試驗期間各組養(yǎng)殖水體中NO3-N的動態(tài)變化(a)Dynamics of NH4-N in aquaculture water during the 33 d incubation;(b)Dynamics of NO2-N in aquaculture water during the 33 d incubation;(c)Dynamics of NO3-N in aquaculture water during the 33 d incubation

海水中亞硝酸氮(NO2-N)作為硝態(tài)氮(NO3-N)和銨態(tài)氮(NH4-N)還原與氧化過程的中間產(chǎn)物[17]，含量相對較低且不穩(wěn)定，但在蝦塘養(yǎng)殖水環(huán)境中含量相對較高，經(jīng)常被作為水質(zhì)的一個考核指標。亞硝酸氮(NO2-N)也是養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，濃度過高同樣會制約對蝦的養(yǎng)殖。如圖3b所示：在養(yǎng)殖前期(2018年5月23日)，4個養(yǎng)殖水池的NO2-N質(zhì)量濃度均為0 mg/L，隨著養(yǎng)殖時間的變化，4個養(yǎng)殖水池的NO2-N質(zhì)量濃度逐漸上升(F=659.806，P=0.000)；到了養(yǎng)殖后期，對照組(組1)水中的亞硝酸氮質(zhì)量濃度均高于試驗組(P<0.050)，達到了0.062 mg/L，而使用了微生物菌劑的試驗組(組2、組3和組4)水體中的亞硝酸氮質(zhì)量濃度維持了較低的水平(P<0.050)。

海水中硝酸氮(NO3-N)是含氮有機物氧化分解的最終產(chǎn)物。水中的氮以硝酸鹽形態(tài)存在，屬低毒性或無毒性。其含量變化主要受海洋生物活動和有機質(zhì)氧化分解的影響。如圖3c所示，隨著養(yǎng)殖時間的變化，4個組中的NO3-N質(zhì)量濃均有增加(F=1 937.649,P=0.000)，但使用微生物菌劑的試驗組(組2、組3和組4)中的NO3-N質(zhì)量濃度始終低于對照組(組1)(P<0.050)。

以上結(jié)果表明，微生物菌劑中的有益微生物能利用水體中的無機氮，使得養(yǎng)殖水體中的NH4-N、NO2-N和NO3-N維持在一個較低的水平，保證了對蝦生存環(huán)境的健康。

3 討論

在本研究中，復合微生物菌劑作為飼料添加劑對對蝦有很明顯的促生長作用，在第33天，對照組與各試驗組的體重具有顯著差異性(P<0.050)，同時復合微生物菌劑還能顯著地提升對蝦的存活率。之前有報道指出，微生物菌劑中含有許多可提高動物免疫能力的生理活性物質(zhì)[18]，復合微生物菌劑中的益生菌定植在對蝦腸道中可增強對蝦的抗病力，提高其成活率[19-21]。Dicks等[22-24]的研究發(fā)現(xiàn)，添加酵母菌、乳酸菌、放線菌、芽孢桿菌和光合細菌等有益菌的復合微生物菌劑不僅可以抑制對蝦體內(nèi)病原菌生長，還能產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，如維生素、類胡蘿卜素和促生長因子等。本文中所用微生物菌劑中的益生菌也具有類似的效果，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可促進宿主消化吸收[25]，因此能夠有效地促進對蝦生長并能凈化水質(zhì)。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，水體DO值和pH值是養(yǎng)殖環(huán)境監(jiān)測的重要指標。本試驗中，DO值在試驗開始時各組數(shù)據(jù)中不具有顯著差異，而在養(yǎng)殖10 d后，對照組與各試驗組數(shù)據(jù)出現(xiàn)顯著差異(P<0.050)，且溶氧量低于試驗組，隨著養(yǎng)殖時間的延長，水體溶氧量會逐漸降低，但是添加微生物菌劑的試驗組水體溶氧量在養(yǎng)殖期間始終高于對照組。養(yǎng)殖環(huán)境的酸堿度也能影響對蝦的生長代謝，在養(yǎng)殖期間，各組pH值呈下降趨勢(F=191.959,P=0.000)，且試驗組為7.0左右，而對照組呈弱堿性環(huán)境。有研究報道，乳酸菌和光合細菌都能增加水體溶氧量，調(diào)控水體酸堿度[26]，這說明微生物菌劑中的乳酸菌可能在調(diào)節(jié)水質(zhì)方面發(fā)揮著重要的作用。

水質(zhì)的好壞是養(yǎng)殖成敗的關(guān)鍵，微生物菌劑中的有益微生物能吸收和利用養(yǎng)殖水體中的無機氮，氨化功能細菌和硝化功能細菌在生物脫氨的各個環(huán)節(jié)中發(fā)揮協(xié)同作用，把有害的亞硝酸氮轉(zhuǎn)化為無害的硝酸鹽和菌體蛋白，從而使養(yǎng)殖水體的水質(zhì)維持在對蝦健康生長的標準，在維持養(yǎng)殖環(huán)境的生態(tài)平衡方面發(fā)揮著重要作用[16,17]。隨著對蝦的生長，各類有毒氮素含量會逐漸增加，在監(jiān)測NH4-N、NO2-N和NO3-N動態(tài)變化的試驗中，除了第0天各組數(shù)據(jù)無顯著差異外(P>0.050)，各試驗組的氮素含量均低于對照組，F(xiàn)值分別為250.633、659.806和1 937.649，P值均為0.000。表明復合微生物菌劑可促進有害氮素轉(zhuǎn)化為無害的硝酸鹽，維持較好的水質(zhì)環(huán)境。

總之，復合微生物菌劑作為飼料添加劑，可增強對蝦的抗病力，促進對蝦的消化吸收生長，在提高幼蝦成活及成蝦產(chǎn)量等問題上有較高的使用價值，且具有捕撈后無獸藥、激素等殘留的優(yōu)點，可有效替代抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應用。作為凈水劑，在消除有機物污染、凈化水質(zhì)的同時，還能有效抑制水體中有害微生物的生長繁殖，顯示出良好的應用效果。