秦泗佳 寧召亮 嚴(yán)喜章 劉昌奎 楊石照

（1 西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，2 陜西省腦疾病防治重點實驗室，西安 710021；3 泰安市口腔醫(yī)院，泰安 271000；4 西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，西安 710021）

眶下神經(jīng)是三叉神經(jīng)上頜神經(jīng)的主要分支，位置表淺，便于操作，是建立三叉神經(jīng)痛動物模型的主要手術(shù)對象[1]。三叉神經(jīng)痛是指該神經(jīng)所支配區(qū)域發(fā)生的陣發(fā)性疼痛，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前比較公認(rèn)且有顯微解剖學(xué)依據(jù)的是局部微血管壓迫學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為血管壓迫神經(jīng)后可導(dǎo)致神經(jīng)微循環(huán)障礙，進(jìn)而引發(fā)脫髓鞘等一系列病理性改變，從而影響動作電位的傳播[2]。已有學(xué)者對三叉神經(jīng)受到微血管壓迫和微血管減壓術(shù)成功情況進(jìn)行了研究[3-8]，但對三叉神經(jīng)正常及受壓后神經(jīng)微血管的具體分布特點仍不清楚，且尚未見有關(guān)眶下神經(jīng)微血管的研究報道。本實驗主要研究SD 大鼠眶下神經(jīng)微血管的分支、分布及走行等解剖結(jié)構(gòu)特點，充實了解剖學(xué)數(shù)據(jù)資料，為三叉神經(jīng)痛發(fā)病機(jī)制的研究提供解剖學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD 大鼠10 只，體質(zhì)量200～210 g，購于大連醫(yī)科大學(xué)SPF 實驗動物中心，雄性。

1.2 主要實驗試劑及軟件

明膠（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；一得閣墨汁（北京）；H-E 染液；體視顯微鏡（Olympus SZ2-ST）；組織切片機(jī)（Leica RM2235）；光學(xué)顯微鏡（Olympus BX43）；焦點堆迭軟件（Zerene Stacker 1.04）。

1.3 灌注、取材及切片

10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉SD 大鼠，開胸暴露心，左心室插管，右心耳放血后，快速灌注0.9% NaCl 溶液，再行4%多聚甲醛溶液灌注，最后用過濾的37℃5%明膠-墨汁混合液灌注至大鼠眼結(jié)膜、口唇及全身皮膚變黑為止。結(jié)扎肺動脈，肺靜脈，上、下腔靜脈和主動脈弓，-4℃冷凍15 min。在體視顯微鏡下解剖游離眶下神經(jīng)，截取眶下神經(jīng)出眶下孔后約2 mm 的一段，放入4%多聚甲醛固定液內(nèi)固定24 h，蒸餾水沖洗10 min。體視顯微鏡下去除5 只SD 大鼠眶下神經(jīng)的外膜，另5 只保留神經(jīng)外膜，兩者均經(jīng)梯度乙醇脫水和二甲苯透明后制成明膠-墨汁灌注透明標(biāo)本，體視顯微鏡下觀察，并進(jìn)行不同焦距層面的拍照。將去除眶下神經(jīng)外膜的透明標(biāo)本經(jīng)無水乙醇去除二甲苯后行石蠟包埋，縱向切片（厚10 μm），60℃烤片3 h，經(jīng)脫蠟、水化、H-E染色、二甲苯透明和中性樹膠封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并進(jìn)行拍照。

1.4 圖像及切片處理

將體視顯微鏡下獲取的不同焦距層面的圖像導(dǎo)入Zerene Stacker 軟件中進(jìn)行焦點堆迭。經(jīng)H-E 染色的切片，光學(xué)顯微鏡下放大400 倍拍照。

2 結(jié)果

2.1 眶下神經(jīng)焦點堆迭

在體視顯微鏡下，將2 只SD 大鼠眶下神經(jīng)放大40 倍，每只每側(cè)各獲取不同焦距層面的圖像25張，將每側(cè)圖像分別進(jìn)行焦點堆迭后各獲得1 張圖像。未去除神經(jīng)外膜的SD 大鼠眶下神經(jīng)部分不同焦距層面的圖像能較清晰顯示該層面部分微血管的分支、分布及走行（圖1A～E），另有部分區(qū)域因聚焦原因和被神經(jīng)外膜及其他層面的組織遮擋顯得模糊。焦點堆迭后的圖像能較清晰顯示眶下神經(jīng)不同層面全部區(qū)域微血管的分支、分布及走行（圖1F）。去除神經(jīng)外膜的SD 大鼠眶下神經(jīng)部分不同焦距層面的圖像能清晰顯示該層面部分微血管的分支、分布及走行（圖2A～E），也另有部分區(qū)域因聚焦原因和被其他層面的組織遮擋顯得模糊。焦點堆迭后的圖像能清晰顯示眶下神經(jīng)不同層面全部區(qū)域微血管的分支、分布及走行（圖2F）。兩者相比圖1比圖2染色深，微血管的清晰度差；圖2染色淺，但微血管的清晰度好?？粝律窠?jīng)微血管的數(shù)量眾多，微血管的密度大，染色深，近心端的微血管管徑比遠(yuǎn)心端的微血管管徑大，微血管走行迂曲，在不同的層面發(fā)出分支并不斷吻合成網(wǎng)，然后沿神經(jīng)纖維方向分支順行，密度隨之降低，染色變淺?？粝律窠?jīng)外膜染色呈大片區(qū)域的深染，近心端染色更深一些（圖1），去除神經(jīng)外膜后能較清晰顯示神經(jīng)內(nèi)微血管的解剖結(jié)構(gòu)（圖2）。

2.2 眶下神經(jīng)H-E 染色

將SD 大鼠眶下神經(jīng)石蠟標(biāo)本縱向切片后行H-E 染色，鏡下放大400 倍后拍照（圖3）。在眶下神經(jīng)纖維之間分布著較多的微血管，微血管管徑較小，密度較大，微血管多沿神經(jīng)纖維縱向迂曲走行，在走行過程中可斜向或縱向發(fā)出分支，吻合成網(wǎng)。

圖3 SD 大鼠眶下神經(jīng)切片H-E 染色，×400Fig3 H-E staining of infraorbital nerve in SD rats，×400

3 討論

目前，有關(guān)三叉神經(jīng)痛發(fā)病機(jī)制的研究結(jié)果表明，神經(jīng)受壓迫致使神經(jīng)微循環(huán)障礙，從而導(dǎo)致神經(jīng)脫髓鞘變而產(chǎn)生神經(jīng)痛的周圍學(xué)說占主流[9-12]。眶下神經(jīng)是三叉神經(jīng)的分支上頜神經(jīng)在面部的1 個終末分支，研究大鼠眶下神經(jīng)微血管的分支、分布及走行解剖特點，可為探究眶下神經(jīng)的血液供應(yīng)及微循環(huán)和三叉神經(jīng)痛的發(fā)病機(jī)制提供參考。大鼠的三叉神經(jīng)與人三叉神經(jīng)的解剖結(jié)構(gòu)有所不同，大鼠的三叉神經(jīng)節(jié)發(fā)出上頜神經(jīng)-眼神經(jīng)干和下頜神經(jīng)2 個分支，即上頜神經(jīng)和眼神經(jīng)共干。神經(jīng)干的遠(yuǎn)段穿行顱底骨的骨管內(nèi)，到達(dá)眶尖后方后分為眼神經(jīng)和眶下神經(jīng)，眶下神經(jīng)經(jīng)眶脂體內(nèi)下方，緊靠眶內(nèi)側(cè)壁，穿過眶下神經(jīng)溝出眶，分布于觸須墊[13]。

焦點堆迭是在同一背景上將多張不同焦點的照片對焦點進(jìn)行拼接成1 幅照片[14]。本研究每只每側(cè)眶下神經(jīng)共獲取不同焦距層面的圖像25 張，進(jìn)行焦點堆迭后各合成1 張圖像，未去除神經(jīng)外膜的眶下神經(jīng)焦點堆迭的圖像較能清晰顯示大鼠眶下神經(jīng)微血管的分支、分布及走向，但沒有去除神經(jīng)外膜的眶下神經(jīng)焦點堆迭的圖像顯得清晰?？粝律窠?jīng)外膜的染色呈深染的大片區(qū)域，近心端的染色更深一些，提示近心端的血管密度更大一些，有局部區(qū)域呈墨浸狀可能是由于神經(jīng)外膜表面上其他組織沒有去除干凈造成組織重疊。圖片中出現(xiàn)的空泡是由于神經(jīng)透明標(biāo)本較厚和切片封片時混入了空氣所致。眶下神經(jīng)微血管的數(shù)量多、密度大、染色深，近心端微血管管徑比遠(yuǎn)心端微血管管徑大，微血管迂曲走行，并在不同的層面發(fā)出分支，不斷吻合成網(wǎng)，沿神經(jīng)纖維方向分支順行，密度隨之降低，染色變淺。微血管吻合成網(wǎng)有助于更好為神經(jīng)纖維提供全方位的營養(yǎng)，沿神經(jīng)纖維走行方向迂曲順行，則有助于在面部肌肉等軟組織發(fā)生位移時為神經(jīng)提供營養(yǎng)。已有研究利用焦點堆迭技術(shù)進(jìn)行了正常大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)微血管解剖結(jié)構(gòu)特點和大鼠三叉神經(jīng)痛模型神經(jīng)微循環(huán)變化的研究，研究結(jié)果表明，此技術(shù)能較好顯示正常大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)微血管的解剖結(jié)構(gòu)特點和三叉神經(jīng)痛模型神經(jīng)微循環(huán)隨著時間推移而發(fā)生的變化[15-17]。

本研究用過濾的37℃5%明膠-墨汁混合液灌注SD 大鼠，游離其眶下神經(jīng)出眶下孔后約2 mm的一小段，經(jīng)石蠟包埋縱向切片后行H-E 染色。去除神經(jīng)外膜雖能夠消除神經(jīng)外膜層面組織結(jié)構(gòu)對神經(jīng)內(nèi)部成像清晰度的影響，但能夠增加在切片和展片過程中神經(jīng)纖維之間分離的危險度，尤其是在順神經(jīng)纖維縱向切片時。明膠-墨汁灌注能較好顯示血管，尤其是微血管，因此經(jīng)常用于研究微循環(huán)，但應(yīng)注意明膠和墨汁的配比，明膠占比過大會增加混合液的黏稠度，不利于完全灌注到微血管中，明膠占比過小則會增加混合液的流動性，不利于混合液停留在微血管中[18-19]。此外還要注意明膠-墨汁混合液的溫度要適宜，本研究采用37℃。H-E 染色能較好顯示神經(jīng)元胞體和神經(jīng)纖維，將H-E 染色與明膠-墨汁灌注結(jié)合起來就能顯示神經(jīng)與血管的關(guān)系，神經(jīng)微血管的分支、分布及走行規(guī)律[20]。在神經(jīng)纖維之間分布著較多的微血管，管徑較小，密度較大，微血管多沿神經(jīng)纖維縱向迂曲走行，在走行過程中可斜向或縱向發(fā)出分支吻合成網(wǎng)，能夠更好為神經(jīng)纖維提供營養(yǎng)，使神經(jīng)適應(yīng)不同的狀態(tài)發(fā)揮相應(yīng)的功能。

綜上所述，通過明膠-墨汁灌注、焦點堆迭和H-E 染色能夠研究大鼠眶下神經(jīng)微血管的解剖結(jié)構(gòu)特點。SD 大鼠眶下神經(jīng)微血管數(shù)量多、密度大，在迂曲走行過程中發(fā)出分支并吻合成網(wǎng)狀。