李 瑞 石婷婷 王 強(qiáng) 張永先

（中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六〇醫(yī)院骨創(chuàng)傷外科，濟(jì)南 250031）

糖尿病患者常發(fā)生糖尿病性骨病，主要表現(xiàn)為骨皮質(zhì)變薄、纖維性骨炎、骨關(guān)節(jié)骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)增生、軟組織鈣化，甚至于出現(xiàn)病理性骨折，可能由于高血糖和脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂而引起[1]。高血糖是導(dǎo)致糖尿病性骨病重要始發(fā)因素，高血糖破壞骨代謝的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的代謝作用產(chǎn)生影響。成骨細(xì)胞的活力降低是導(dǎo)致糖尿病性骨病的主要原因[2]。因此，如何維持高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞的活性，是降低糖尿病性骨病發(fā)生的重要方式。核呼吸因子1（nuclear respiratory factor 1，NRF1）是CNC-bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族成員[3]，直接參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。近年的研究證明NFR1 在骨代謝中也發(fā)揮重要作用。高糖環(huán)境下，成骨細(xì)胞的凋亡是糖尿病性骨病發(fā)生的重要過程，但是相關(guān)機(jī)制尚不明確。本研究擬通過觀察高糖處理時(shí)成骨細(xì)胞NRF1 的表達(dá)，分析高糖環(huán)境下過表達(dá)NRF1對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響，以期為糖尿病性骨病的研究提供新的治療依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人hFOB 1.19細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Flag-NRF1質(zhì)粒為Raymond Deshaies教授贈(zèng)予（Addgene 質(zhì)粒編號(hào)為34707）[4]；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；兔抗NRF1抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；β-actin一抗和HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自武漢博士德公司；BCA試劑盒、PVDF膜以及其他相關(guān)試劑均購(gòu)于上海碧云天生物科技公司；ELISA檢測(cè)試劑盒[腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）貨號(hào)RTA00，白細(xì)胞介素1-β（interleukin-1β，IL-1β）貨號(hào)RL B00；IL-6貨號(hào)R6000B]購(gòu)自美國(guó)R＆D Systems公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人hFOB 1.19 細(xì)胞采用37 ℃含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，DMEM 低糖培養(yǎng)基（葡萄糖5.5 mmol/L）內(nèi)加入10%的胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素。細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)采用胰酶消化傳代培養(yǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用12 孔板培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)50%時(shí)，采用LipofectamineTM2000 按試劑使用說明轉(zhuǎn)染Flag-NRF1 質(zhì)粒和空白對(duì)照質(zhì)粒，分別設(shè)為NRF1 組和空載體組。參照參考文獻(xiàn)[5]，高糖培養(yǎng)基采用濃度為22.0 mmol/L。人hFOB 1.19 細(xì)胞和轉(zhuǎn)染細(xì)胞（NRF1 組和空載體組）使用高糖培養(yǎng)基（高糖處理組）或者一般低糖培養(yǎng)基（低糖對(duì)照組）培養(yǎng) 7 d 后，分別檢測(cè)蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡和促炎癥因子水平。

1.3 免疫印跡檢測(cè)NRF1 蛋白表達(dá)

收集處理后細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后，采用兔抗人NRF1 抗體和小鼠抗人GAPDH 抗體（1∶1 000 稀釋），4 ℃孵育16 h，洗滌后加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶3 000 稀釋），37℃孵育1 h，采用ECL 發(fā)光試劑盒在凝膠成像儀采集圖像。Image J 軟件分析灰度值，獲得相對(duì)蛋白濃度。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分析高糖處理后轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡比例

NRF1 組和空載體組的細(xì)胞經(jīng)高糖處理7 d 后，離心收集全部細(xì)胞。PBS 洗滌后，使用Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒染色。使用BD FACS Calibur 流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)數(shù)據(jù)使用FlowJo.7.6.1 軟件（BD Biosciences）分析，每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.5 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中促炎細(xì)胞因子的水平

收集培養(yǎng)高糖處理7 d 后細(xì)胞的培養(yǎng)基，使用ELISA 試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IL-1β、TNF-α 和IL-6 的表達(dá)水平，用BIO-RAD Model 550 酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果，每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 高糖處理時(shí)成骨細(xì)胞NRF1 的表達(dá)

與低糖對(duì)照組（0.82±0.17）相比，高糖處理組的人hFOB 1.19 成骨細(xì)胞中NRF1 蛋白表達(dá)量顯著降低（0.10±0.02，P＜0.05），提示高糖可抑制成骨細(xì)胞NRF1 的表達(dá)（圖1）。

圖1 免疫印跡檢測(cè)成骨細(xì)胞NRF1 蛋白表達(dá) Fig1 Expression of NRF1 protein in osteoblasts detected by Western blotting

2.2 成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染NRF1 或者空載體

采用NRF1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hFOB 1.19細(xì)胞，上調(diào)NRF1表達(dá)水平，空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建空載體組細(xì)胞。采用高糖處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞，免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，相比空載體組（0.12±0.07），NRF1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后hFOB 1.19細(xì)胞的NRF1蛋白表達(dá)水平顯著升高（0.88±0.23，P＜0.05），證實(shí)NRF1模型制備成功。高糖處理后，NRF1組細(xì)胞NRF1表達(dá)水平（0.79±0.11）與hFOB 1.19低糖對(duì)照組細(xì)胞（對(duì)照組）水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.88±0.23，P＞0.05）（圖2）。

圖2 免疫印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞NRF1 蛋白表達(dá)Fig2 Expression of NRF1 protein in transfected osteoblasts detected by Western blotting

2.3 上調(diào)NRF1 表達(dá)對(duì)高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞檢測(cè)顯示，與空載體組比較，高糖處理后NRF1 組的成骨細(xì)胞凋亡率呈明顯降低趨勢(shì)，分別為35.52%±9.55%和14.05%±2.13%（P＜0.05）（圖3）。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組成骨細(xì)胞凋亡率Fig3 Cell apoptosis rate of osteoblasts in each group detected by flow cytometry

2.4 NRF1 調(diào)控成骨細(xì)胞促炎癥因子分泌

通過ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中促炎細(xì)胞因子的水平，結(jié)果表明，與空載體組相比，NRF1 組的成骨細(xì)胞中分泌的TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平均顯著降低（P＜0.05）（圖4）。

圖4 ELISA 法檢測(cè)各組成骨細(xì)胞促炎癥因子分泌水平Fig4 Levels of secreted pro-inflammatory factors in each group detected by ELISA assays

3 討論

近年來糖尿病性骨病作為常見的代謝性疾病在發(fā)病率上呈明顯上升趨勢(shì)[6]。相關(guān)因素分析顯示成骨細(xì)胞的功能障礙是重要機(jī)制之一。成骨細(xì)胞參與骨組織的礦化和重建，是骨代謝的關(guān)鍵功能細(xì)胞之一。成骨細(xì)胞發(fā)生功能障礙時(shí)，骨組織量顯著減少，而骨吸收明顯增加；同時(shí)成骨細(xì)胞的功能障礙會(huì)打破破骨與成骨過程的平衡，增加骨質(zhì)疏松和骨折發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[7]。通過維持成骨細(xì)胞的活性，可以改善糖尿病患者的骨代謝平衡，避免糖尿病性骨病的發(fā)生。

NRF1 在多種組織中均有表達(dá)，參與介導(dǎo)抗氧化反應(yīng)，在細(xì)胞組織發(fā)育、分化等多種過程中發(fā)揮重要作用。胰島β 細(xì)胞NRF1 的缺失可以導(dǎo)致血漿基礎(chǔ)胰島素水平升高，但在高糖刺激下，胰島素分泌水平則顯著下降[8]。在大樣本人群調(diào)查中顯示，NRF1 的表達(dá)水平與血清成骨細(xì)胞中的相關(guān)指標(biāo)關(guān)系密切，呈正相關(guān)[9]。

本研究結(jié)果顯示經(jīng)高糖處理后，成骨細(xì)胞NRF1 表達(dá)水平明顯下降。上調(diào)NRF1 的表達(dá)水平，高糖處理成骨細(xì)胞的凋亡率顯著下降，提示NRF1參與成骨細(xì)胞在高糖環(huán)境下的生存維持。以往研究表明NRF1 通過調(diào)節(jié)線粒體細(xì)胞色素c 釋放，直接參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[10]。相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制尚需要進(jìn)一步的研究。

NRF1 作為轉(zhuǎn)錄因子，直接與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的抗氧化元件結(jié)合，實(shí)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)多種基因的表達(dá)調(diào)控。既往研究提出IL-1β 參與細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)，活性轉(zhuǎn)化的IL-1β 直接參與基質(zhì)蛋白分解，并通過激活其他家族成員介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。IL-6影響多種細(xì)胞的增殖與分化，其高水平表達(dá)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[12]。TNF-α 通過TNF 受體1 介導(dǎo)凋亡信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。抑制促炎性細(xì)胞因子尤其是TNF-α、IL-1β、IL-6 分泌，可能是NRF1 抑制成骨細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。本研究結(jié)果顯示NRF1 上調(diào)表達(dá)后，成骨細(xì)胞分泌的IL-1β，IL-6 和TNF-α 細(xì)胞因子呈顯著降低，可能是NRF1 抑制成骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

NRF1 屬于CNC-bZIP 蛋白家族，該家族存在多個(gè)家族成員，包括抗氧化反應(yīng)核心調(diào)控因子Nrf2以 及Nrf3、NF-E2p45、Bach1、Bach2 等。此 外，Nrf1 通過基因上的不同啟動(dòng)子和mRNA 加工過程，從單一基因可產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，并編碼出不同屬性和功能的蛋白亞型[14]。本研究過表達(dá)的NRF1 是全長(zhǎng)NRF1 的轉(zhuǎn)錄本[14]。不同家族成員之間的相互作用，以及不同轉(zhuǎn)錄本之間的功能差異，還有待進(jìn)一步研究。