何 煒 劉風(fēng)藏 于國霞 王 磊△

（1 華北石油管理局總醫(yī)院功能檢查科，任丘 062552；2 河北醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室，石家莊 050017；3 石家莊市婦幼保健院藥劑科，石家莊 050051）

腎缺血再灌注損傷（renal ischemia-reperfusion injury，RIRI）是手術(shù)治療腎臟疾病過程中常見的病理生理現(xiàn)象[1]。腎在缺血及其后的血液再灌注過程中會有大量活性氧族（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，導(dǎo)致腎損傷。因此，氧化應(yīng)激被認為是引發(fā)RIRI 的主要機制之一[2-3]。本課題組前期研究表明，RIRI 發(fā)生后，肝臟也會遭受過氧化損傷[4]。核因子NF-E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)抗氧化蛋白的表達[5-6]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutases，SOD）是重要的抗氧化酶，可清除ROS，同時也是Nrf2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因之一[7]。萊菔硫烷（sulforaphane，SFN）是Nrf2 通路的誘導(dǎo)劑，可上調(diào)Nrf2 及其靶基因，發(fā)揮抗氧化等生物學(xué)作用[8]。本研究給予RIRI 模型大鼠SFN，觀察肝組織形態(tài)、功能、過氧化損傷及SOD 的表達變化，探討SFN 在防治RIRI 誘發(fā)的肝損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1 RIRI 模型的制備、分組和樣品采集

24 只雄性Wistar 大鼠（200±10）g，隨機分為對照組（Control 組）、RIRI 組、缺血+SFN 組（SFN1組），灌注+SFN 組（SFN2 組）。RIRI 組參照余曉東等[9]的方法建立RIRI 動物模型。腹腔注射6%水合氯醛（5 mL/kg）麻醉大鼠，充分暴露雙側(cè)腎，切除右側(cè)腎，無創(chuàng)動脈夾在靠近腎門處夾閉左側(cè)腎動脈，阻斷血供45 min 后棄去動脈夾，重新恢復(fù)左側(cè)腎的血液供應(yīng)。對照組大鼠切除右側(cè)腎，并分離左側(cè)腎動脈，但并不夾閉。SFN1 組大鼠在夾閉左側(cè)腎動脈后立即將二甲基亞砜稀釋的SNF 均勻涂抹于小腸表面，SFN2 組大鼠在棄去血管夾恢復(fù)血液灌注時立即將SNF 均勻涂抹于小腸表面，其余操作步驟同RIRI 組。對照組和RIRI 組只在小腸表面涂抹等量的二甲基亞砜。灌注24 h 后收集血液，3 000 r/min，離心10 min，收集血清用于谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）測定；4%多聚甲醛固定肝，用于H-E 染色觀察大鼠肝形態(tài)學(xué)變化。其余肝置于液氮中，用于丙二醛（malondialdehyde，MDA）和H2O2含量，SOD 活性、SOD mRNA 和蛋白表達水平測定。

1.2 大鼠肝形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

H-E 染色觀察肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)：4%多聚甲醛固定肝組織，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，切片厚度5 μm，脫蠟至水，H-E 染色，脫水、二甲苯透明2～5 min、中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.3 血清ALT 活性測定

采用微板法檢測ALT 活性，檢測過程按南京建成檢測試劑盒說明書進行。

1.4 肝組織MDA 含量檢測

冰凍肝組織按20 mg/100 μL的比例加入預(yù)冷生理鹽水快速勻漿，勻漿液4 000 r/min，4℃離心 20 min，收集約150 μL上清液，按照1∶1的比例于上清液內(nèi)加入150 μL生理鹽水，即為10%肝組織勻漿，作為待測樣本。勻漿液中MDA含量采用南京建成MDA測定試劑盒檢測，以每克肝組織蛋白中所含MDA的量（mmol/g pro）代表肝勻漿MDA含量。

1.5 肝組織H2O2含量和SOD 活性測定

冰凍肝組織按重量體積比1∶9 加入預(yù)冷生理鹽水，快速勻漿，勻漿液10 000 r/min，4℃離心10 min，收集上清即為10%肝組織勻漿。勻漿液中H2O2含量和SOD 活性均采用南京建成測定試劑盒檢測，每克肝組織蛋白中所含H2O2的量（mmol/gpro）代表肝勻漿H2O2含量；每毫克樣本蛋白所含的酶活性單位（U/mg pro）表示肝組織SOD 活性。

1.6 肝組織SOD mRNA 水平測定

采用RNA提取試劑盒提取肝組織總RNA。2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成模板cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參照，Real-time PCR測定SOD mRNA表達水平。

1.7 肝組織SOD 蛋白水平測定

免疫印跡法測定大鼠肝組織SOD 蛋白水平。大鼠肝組織勻漿，離心后取上清。電泳蛋白上樣量為62 μg。經(jīng)過轉(zhuǎn)膜和封閉處理，PVDF 膜上加入SOD 抗體（購于Abcam 公司），室溫靜置過夜。再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG 抗體（購于Zymed公司）。雙色紅外線成像系統(tǒng)拍照并進行圖像分析，以SOD 與GAPDH 條帶積分光密度值之比表示其蛋白含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變

光鏡下可見，對照組大鼠肝細胞大小均勻，圍繞中央靜脈排列成條索狀，肝血竇大小均勻未見異常；RIRI 組大鼠肝細胞萎縮，體積變小，肝血竇擴張；SFN1 組大鼠肝細胞腫脹，體積增大，肝血竇被擠壓變窄，偶可見空泡變性；SFN2 組大鼠部分肝細胞萎縮，肝血竇略有擴張，肝細胞內(nèi)可見有大量空泡，數(shù)量多于SFN1 組（圖1）。

圖1 對照組（A）、RIRI 組（B）、SFN2 組（C）、SFN1 組（D）肝形態(tài)結(jié)構(gòu)H-E 染色，標(biāo)尺=50 μm，×400Fig1 Microstructure of the liver in the control group（A），RIRI group（B），SFN2 group（C）and SFN1 group（D），H-E staining，bar=50 μm，×400

2.2 血清ALT 活性改變

各組大鼠血清內(nèi)ALT 活性分別為：對照組（86.35 ±12.22）U/L、RIRI 組（210.27±29.94）U/L、SFN2 組（161.71±21.75）U/L、SFN1組（132.75 ±20.51）U/L。與對照組相比，RIRI組、SFN2 組、SFN1 組ALT活性均明顯升高（P＜0.05），SFN2 組和SFN1 組ALT 活性低于RIRI組（P＜0.05），SFN1 組又低于SFN2 組（P＜0.05）。

2.3 肝組織MDA、H2O2含量的改變

與對照組相比，RIRI 組、SFN2 組，SFN1 組大鼠肝組織MDA 和H2O2含量明顯升高（P＜0.05），但SFN2 組和SFN1 組肝 組織MDA 和H2O2含量明顯低于RIRI 組（P＜0.05），SFN1 組又低于SFN2 組（P＜0.05）（表1）。

2.4 肝組織SOD 活性改變

大鼠肝組織SOD 活性分別為：對照組（133.33±14.21）U/mg pro、RIRI 組（53.36±7.28）U/mg pro、SFN2 組（73.46±8.96）U/mg pro、SFN1 組（86.75 ±10.16）U/mg pro。與對 照組 相比，RIRI 組、SFN2 組、SFN1 組SOD 活性均降低（P＜0.05），SFN2 組和SFN1 組SOD 活性高于RIRI組（P＜0.05），SFN1組又高于SFN2組（P＜0.05）。

表1 肝MDA、H2O2 含量（n=6，±s，mmol/g pro）Tab1 MDA and H2O2 content in the liver（n=6，±s，mmol/g pro）

表1 肝MDA、H2O2 含量（n=6，±s，mmol/g pro）Tab1 MDA and H2O2 content in the liver（n=6，±s，mmol/g pro）

*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs RIRI group；△P＜0.05 vs SFN2 group

Group MDA H2O2 Control 42.08±6.35 55.49±8.75 RIRI 96.49±12.38*124.15±18.52*SFN2 68.86±9.15*# 96.09±12.14*#SFN1 54.62 ±9.57*#△ 75.00 ±11.14*#△

2.5 肝組織SOD 基因的表達改變

與對照組相比，RIRI組、SFN2組、SFN1組大鼠肝組織SOD mRNA表達水平均升高（P＜0.05）。SFN2組和SFN1組大鼠肝組織的SOD mRNA相對表達水平又高于RIRI組（P＜0.05），但SFN2組和SFN1組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖2A）。

2.6 肝組織SOD 蛋白的表達改變

與對照組相比，RIRI 組、SFN2 組、SFN1 組大鼠肝組織SOD 蛋白表達水平均升高（P＜0.05）。SFN2 組和SFN1 組大鼠肝組織SOD 蛋白相對表達水平又高于RIRI 組（P＜0.05），但SFN2 組 和SFN1 組SOD 蛋白相對表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖2B）。

圖2 肝SOD mRNA（A）和蛋白（B）的表達Fig2 Expression of SOD mRNA（A）and protein（B）in the liver

3 討論

首先，本研究觀察了肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的改變。顯微鏡及ALT 結(jié)果顯示：RIRI 組、SFN1組、SFN2 組3 組大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)和功能均已受損，且RIRI 組最為嚴重，SFN1 組損傷輕于SFN2 組。提示腎缺血再灌注導(dǎo)致了大鼠肝形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能嚴重受損，SFN 處理能明顯改善肝組織結(jié)構(gòu)，減輕肝功能損傷，且缺血后即刻給予SFN 的改善作用要優(yōu)于再灌注后給予SFN。

其次，本研究檢測了肝組織H2O2和MDA的含量。H2O2是引發(fā)過氧化損傷的一個主要因素[11]。以H2O2含量反映肝組織內(nèi)的ROS 含量即氧化應(yīng)激水平。MDA 是組織細胞發(fā)生過氧化損傷的標(biāo)志物之一[12]。實驗結(jié)果顯示：RIRI 組、SFN1 組、SFN2組3 組大鼠肝組織內(nèi)H2O2和MDA 含量均明顯升高。說明在RIRI 發(fā)生時，肝也已發(fā)生氧化應(yīng)激，遭受過氧化損傷，這與本課題組前期研究結(jié)果一致。SFN1 組和SFN2 組含量明顯低于RIRI 組，SFN1 組又低于SFN2 組。說明在大鼠肝組織氧化應(yīng)激水平和過氧化損傷程度上，RIRI 組最為嚴重，SFN1 組又輕于SFN2 組。此結(jié)果提示，SFN 處理明顯降低了肝組織的ROS 含量，減輕了肝組織過氧化損傷的程度，并且缺血后即刻給予SFN 的抗氧化作用要比再灌注后給予強。

最后，本研究檢測了肝組織SOD 的活性及表達變化。SOD 是機體內(nèi)清除超氧陰離子的重要抗氧化酶[13-14]。SOD 活性結(jié)果顯示，RIRI 組、SFN1組、SFN2 組3 組大鼠肝組織內(nèi)SOD 活性均降低，SFN1 組 和SFN2 組SOD 活性要高于RIRI組，提 示SFN 處理減輕了肝組織SOD 活性的喪失，而SFN1組又高于SFN2 組，提示缺血后即刻給予SFN 的效果要優(yōu)于再灌注后給藥。筆者推測，RIRI 發(fā)生時，肝組織有大量ROS 產(chǎn)生，引發(fā)肝組織發(fā)生過氧化損傷，導(dǎo)致其SOD 活性降低，SFN 降低了肝組織ROS 的含量，從而減緩了SOD 活性的喪失，而SFN1 組要比SFN2 組效果更好，是因為SFN1 組的SFN 提早作用了45 min。

SOD表達變化結(jié)果顯示，RIRI組SOD mRNA和蛋白表達水平均高于對照組，筆者推測，由于ROS堆積，機體反饋性上調(diào)SOD的表達導(dǎo)致其升高。SFN1組和SFN2組的SOD表達又高于RIRI組，這是SFN誘導(dǎo)Nrf2上調(diào)SOD表達所致。SFN1組和SFN2組SOD表達無差異，SOD表達變化沒有與活性變化平行，推測SFN1組給藥早，其SOD表達提前升高后降低了肝組織ROS的含量，從而提前減緩了SOD活性的喪失，因此SFN1組SOD活性比SFN2組高，給藥24 h后2組SFN對SOD表達的影響作用已趨近相同，導(dǎo)致2組SOD表達水平無差異。

綜上所述，RIRI發(fā)生后，SFN可上調(diào)肝組織SOD的表達，增強肝對ROS的清除作用，降低肝組織氧化應(yīng)激水平和過氧化損傷程度，改善肝的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能。并且缺血后即刻給予SFN處理對于肝組織的抗氧化保護作用要優(yōu)于再灌注后給藥。