劉立，蓋金娜，尹作文，陳琴華

0 引言

胃癌是我國(guó)最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率位居全球腫瘤發(fā)病率和死亡率的第二位[1-2]。胃癌的早期診斷率低，臨床診治時(shí)常被延誤[2-3]。腫瘤標(biāo)志物的出現(xiàn)為早期胃癌的診斷帶來了新的希望[4-5]。雖然目前已發(fā)現(xiàn)多種用于胃癌檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物，但其特異性均不高，敏感度也不甚理想[6]。晚期胃癌患者的臨床治療手段仍以化療為主，至今仍沒有公認(rèn)的治療標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。近些年，免疫治療已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，多項(xiàng)研究提示免疫治療在未來的腫瘤治療中有巨大前景[8-10]。報(bào)道指出，多種細(xì)胞因子在腫瘤免疫中發(fā)揮作用，已被用于腫瘤的免疫治療[11-12]。CXC趨化因子配體-5（CXC chemokine ligand-5,CXCL5），又稱為上皮中性粒細(xì)胞活化肽78（ENA78），是CXC趨化因子家族的成員之一[13-14]。作為炎性介質(zhì)，CXCL5對(duì)中性粒細(xì)胞有很強(qiáng)的趨化作用[15]。此外，CXCL5可與其特異性受體CXCR2結(jié)合，介導(dǎo)一系列生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)而影響腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移[15]。研究指出，CXCL5與非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、肝癌等的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[16-19]。而CXCL5在胃癌中的確切作用機(jī)制尚無報(bào)道，本研究探討CXCL5對(duì)胃癌腫瘤免疫的影響及其潛在分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料來源

本研究共納入華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院胃腸外科于2018年7月—2019年4月收治的83例胃癌患者作為研究對(duì)象進(jìn)行回顧性研究；患者年齡在23～79歲之間，平均年齡51.3±13.8歲；所有患者中男55例、女28例。所有患者均為首次被診斷為胃癌，均經(jīng)病理學(xué)或影像學(xué)（或內(nèi)鏡）確診。排除復(fù)發(fā)性胃癌患者、放化療史的患者、并發(fā)其他惡性腫瘤的患者、近期服用影響機(jī)體免疫藥物的患者、伴有全身感染性疾病的患者、臨床資料不全無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)的患者、伴有嚴(yán)重臟器功能障礙的患者、妊娠期或哺乳期女性。胃癌患者的基本信息見表1。

另選取同期在我院體檢科體檢的健康者40 例作為對(duì)照；年齡在29～67 歲之間，平均年齡48.6±14.1歲，其中男27例、女13例。兩組年齡與性別相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），有可比性。所有納入者均簽署知情同意書，均知曉本研究的目的與方法，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 83例胃癌患者的基本信息Table 1 Basic data of 83 gastric cancer patients

1.2 材料與設(shè)備

DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（FBS）、青霉素和鏈霉素（美國(guó)Hyclone公司）。人胃癌細(xì)胞株SNU216和小鼠胃癌細(xì)胞株MFC購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞庫。Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Thermo Fisher公司）。小鼠淋巴細(xì)胞分離液（深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）。人CXCL5 ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）。重組人CXCL5蛋白（上海美迪西生物醫(yī)藥股份有限公司）。SDS-PAGE試劑（上海生工生物工程股份有限公司）。CXCL5抗體、CXCR2抗體、p-ERK1/2抗體、p-MAPK抗體、p-β-catenin抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；p-PI3K抗體、p-AKT抗體、p-NF-κB抗體（美國(guó)CST公司）；MAPK抗體、PI3K抗體、NF-κB抗體、β-catenin抗體（美國(guó)Abcam公司）；ERK1/2抗體、AKT抗體、β-actin抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。NF-κB信號(hào)通路抑制劑BAY 11-7082（美國(guó)MCE公司），Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑XAV939（美國(guó)Selleckchem公司）。流式細(xì)胞術(shù)抗體：FITC標(biāo)記的CD4抗體、APC標(biāo)記的CD8抗體、FITC標(biāo)記的CD56抗體、PE標(biāo)記的CD16抗體（美國(guó)BioLegend公司）。pLVX-Tight-Puro質(zhì)粒（美國(guó)Invitrogen公司）。Taq酶（武漢擎科生物技術(shù)有限公司）。內(nèi)切酶BamHⅠ與EcoRⅠ（美國(guó)Thermo Fisher公司）。T4 DNA連接酶（日本TaKaRa公司）。C57小鼠購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。主要設(shè)備有生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、垂直電泳儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀、Tecan酶標(biāo)儀等。

1.3 酶聯(lián)免疫檢測(cè)CXCL5水平

分別抽取胃癌患者和健康者的空腹靜脈血10 ml，置于促凝管中，自然凝固，2600 r/min離心15 min，取上清液儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆谩XCL5 ELISA試劑盒檢測(cè)血清中CXCL5的水平，檢測(cè)過程嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。用Tecan酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算CXCL5濃度。

1.4 Western blot檢測(cè) CXCL5、CXCR2及NF-κB、β-catenin、ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路

取新鮮或-80℃凍存的患者腫瘤組織、癌旁正常組織和小鼠腫瘤組織，碾磨后用含cocktail蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進(jìn)行裂解，超聲后12000 r/min離心，取上清液即為總蛋白。貼壁細(xì)胞用PBS潤(rùn)洗，吸棄后加入含cocktail蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進(jìn)行裂解，收集裂解液，超聲后12000 r/min離心，取上清液即為總蛋白。組織與細(xì)胞樣品的蛋白濃度均用BCA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。SDS-PAGE電泳用5%的濃縮膠與12%的分離膠進(jìn)行，每孔上蛋白樣80～100 μg。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%BSA封閉，一抗4℃孵育過夜。洗滌，二抗室溫孵育，洗滌，DAB顯色。

1.5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CXCL5與CXCR2

采用SP法檢測(cè)胃癌患者腫瘤及癌旁正常組織中CXCL5與其受體CXCR2的表達(dá)。將10%甲醛溶液固定過夜的組織進(jìn)行石蠟包埋與切片，所有切片常規(guī)脫蠟至水，加0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH6.0），用高壓鍋進(jìn)行抗原熱修復(fù)，加3%H2O2室溫避光孵育30 min，PBS洗滌3次。滴加10%的正常非免疫羊血清，37℃孵育60 min，PBS洗滌3次。滴加CXCL5或CXCR2一抗工作液（稀釋比例為1:50），4℃孵育過夜，PBS洗滌3次。滴加二抗工作液（稀釋比例為1:200），37℃孵育60 min，PBS洗滌3次。滴加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃孵育60 min，PBS洗滌3次。用DAB顯色、蘇木精對(duì)比染色、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照。用Image Pro Plus軟件計(jì)算陽性染色的平均吸光度。

1.6 質(zhì)粒構(gòu)建與穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株建立

根據(jù)人CXCL5的mRNA序列（NM_002994.5）和pLVX-Tight-Puro載體圖譜，設(shè)計(jì)引物序列，上游引物：5’-CCGGGATCCATGAGCCTCCTGTCCAGC-3’（BamHⅠ）；下游引物：5’-CCCGGTAGAATTCGTTTTCCTTGTTTCCACC-3’（EcoRⅠ）。從人胃癌細(xì)胞株SNU216中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)Taq酶的說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)鑒定、純化后備用。用BamHⅠ和EcoRⅠ酶對(duì)pLVX-Tight-Puro質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)鑒定、純化后備用。根據(jù)T4連接酶的說明書將cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物與酶切質(zhì)粒進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化與鑒定后提取質(zhì)粒備用。pLVX-CXCL5質(zhì)粒構(gòu)建成功后根據(jù)pLVX-Tight-Puro的說明書包裝慢病毒。慢病毒感染SNU216或MFC細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)CXCL5的細(xì)胞。

1.7 小鼠移植瘤模型的建立

將30只C57小鼠隨機(jī)分為CXCL5過表達(dá)組和對(duì)照組，每組15只。將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的穩(wěn)定過表達(dá)CXCL5或?qū)φ招∈笪赴㎝FC細(xì)胞消化、離心、PBS重懸、計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×107/ml，無菌條件下將細(xì)胞接種于C57小鼠左前肢腋窩結(jié)合部皮下，每只0.1 ml。接種后第3天起隔天記錄各小鼠的腫瘤大小，繪制腫瘤生長(zhǎng)與生存曲線。用Western blot分析各組小鼠腫瘤組織中CXCL5、磷酸化NF-κB與磷酸化β-catenin的表達(dá)水平。分離小鼠胃癌移植瘤細(xì)胞。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)移植瘤中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞與CD56+CD16+NK細(xì)胞比例。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T、CD8+T與CD56+CD16+ NK細(xì)胞

分離小鼠胃癌移植瘤組織切塊，置于RPMI1640培養(yǎng)基中消化過夜、研磨、過不銹鋼網(wǎng)過篩，經(jīng)PBS洗滌后制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并將細(xì)胞濃度調(diào)整到1.0×107/ml，取0.5 ml細(xì)胞懸液加入離心管。根據(jù)抗體的使用說明書將待測(cè)抗體（CD4、CD8、CD56或CD16）以適當(dāng)比例加入離心管中。渦旋混勻并將離心管置于避光處室溫孵育30 min。低速離心機(jī)1500 r/min離心5 min后棄上清液，并用PBS洗滌3次。再次棄上清液后加入0.3 ml的PBS重懸。渦旋混勻后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)分析均采用SPSS20.0進(jìn)行。采用Graph Pad Prism 5.0進(jìn)行作圖。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分比（n（%））表示，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（>）表示。采用t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析兩獨(dú)立樣本之間的差異，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)數(shù)資料分析。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均為雙尾檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者血清及組織中CXCL5水平分析

共納入83例胃癌患者。ELISA分析顯示胃癌患者的血清CXCL5水平為（263.1±37.9）ng/L，顯著高于健康者的（158.6±18.3）ng/L。Western blot與免疫組織化學(xué)分析顯示，胃癌患者腫瘤組織中的CXCL5及其受體CXCR2的水平均顯著高于癌旁正常組織，見圖1。

2.2 CXCL5水平與臨床特征的關(guān)系

根據(jù)患者腫瘤組織中CXCL5的表達(dá)水平，以所有患者的平均吸光度值為界限將所有患者分為CXCL5低表達(dá)組（CXCL5Low）與CXCL5高表達(dá)組（CXCL5High）。CXCL5低表達(dá)組26例、CXCL5高表達(dá)組57例。胃癌患者中CXCL5高表達(dá)與CXCL5低表達(dá)組的年齡、性別、組織學(xué)類型與漿膜浸潤(rùn)相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。CXCL5高表達(dá)組患者的分化程度顯著低于CXCL5低表達(dá)組（P＜0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和TNM分期均顯著高于CXCL5低表達(dá)組（均P＜0.05），見表2。

2.3 CXCL5對(duì)胃癌細(xì)胞信號(hào)通路的影響

Western blot顯示CXCL5過表達(dá)能顯著增加SNU216與MFC細(xì)胞中p-NF-κB與p-β-catenin的表達(dá)水平，而不影響p-ERK、p-PI3K與p-AKT的表達(dá)水平，見圖2A。進(jìn)一步分析顯示，重組CXCL5蛋白（rCXCL5）也能顯著增加SNU216與MFC細(xì)胞中p-NF-κB與p-β-catenin的表達(dá)水平，見圖2B。

2.4 小鼠模型的建立與分析

與對(duì)照組相比，CXCL5過表達(dá)組胃癌移植瘤小鼠的腫瘤體積顯著增高（P＜0.05），見圖3A；生存期顯著降低（P=0.006），見圖3B。Westernblot結(jié)果顯示CXCL5過表達(dá)組中CXCL5、p-NF-κB與 p-β-catenin的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，見圖3C。流式分析結(jié)果顯示CXCL5過表達(dá)組中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞與CD56+CD16+NK細(xì)胞數(shù)量均顯著低于對(duì)照組，見圖3D～E。

表2 CXCL5的表達(dá)與胃癌患者臨床特征的關(guān)系Table 2 Relation between CXCL5 expression and clinical characteristics of gastric cancer patients

3 討論

胃癌的病理學(xué)發(fā)生機(jī)制涉及多種基因與信號(hào)通路的改變，而其確切的發(fā)病機(jī)制尚未被完全闡明。因此，進(jìn)一步研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的生物指標(biāo)和治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。CXCL5可通過其ELR功能區(qū)與CXCR2結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移[15-16]。研究指出，CXCL5與非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、肝癌等的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[16-18]。多項(xiàng)報(bào)道指出胃癌患者的血清CXCL5水平高于健康者[19]。而CXCL5在胃癌中的確切作用機(jī)制尚無報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，胃癌患者血清與腫瘤組織中的CXCL5水平均出現(xiàn)顯著升高。同時(shí)，與對(duì)照組小鼠相比，過表達(dá)CXCL5組胃癌移植瘤小鼠的腫瘤體積顯著增高，生存期顯著降低。這些結(jié)果提示CXCL5可能參與胃癌的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制。

圖1 胃癌患者血清(A)及腫瘤組織(B,C)中的CXCL5水平Figure 1 Expression of CXCL5 in serum(A) and tumor tissues(B,C) of gastric cancer patients

圖2 CXCL5過表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞信號(hào)通路的影響Figure 2 Effect of CXCL5 overexpression on signal pathways of gastric cancer cells

胃癌腫瘤組織中NF-κB的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，且NF-κB的表達(dá)與胃癌的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[20]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路作用廣泛，Wnt/β-catenin信號(hào)通路亦與胃癌密切相關(guān)[21]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，多種靶向Wnt/β-catenin信號(hào)通路的治療均能有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[21]。本研究中CXCL5過表達(dá)與重組CXCL5蛋白處理均能顯著增加SNU216與MFC細(xì)胞的p-NF-κB與p-β-catenin的表達(dá)水平，而不影響p-ERK、p-PI3K與p-AKT的表達(dá)水平，提示CXCL5可能通過NF-κB與Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮促胃癌的作用。

免疫治療利用腫瘤的免疫學(xué)特性殺滅腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織[9-10]，現(xiàn)已成為腫瘤治療的熱點(diǎn)之一[8]。腫瘤的免疫治療通過調(diào)動(dòng)宿主的免疫系統(tǒng)，使宿主對(duì)腫瘤的殺傷能力增強(qiáng)，進(jìn)而消滅腫瘤細(xì)胞[8-9]。研究指出，與健康者相比，胃癌患者免疫細(xì)胞（如CD4+T細(xì)胞等）的數(shù)量均出現(xiàn)顯著降低[22]。本研究中，CXCL5過表達(dá)組胃癌移植瘤小鼠的腫瘤組織中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞與CD56+CD16+NK細(xì)胞的數(shù)量均顯著低于對(duì)照組。因此，CXCL5可能通過NF-κB與Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮抑制胃癌腫瘤免疫的作用。

綜上所述，胃癌患者腫瘤組織及血清中CXCL5水平均顯著升高，CXCL5可能通過激活NF-κB與Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制胃癌的腫瘤免疫活性進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)胃癌的作用。

圖3 CXCL5過表達(dá)對(duì)胃癌移植瘤小鼠模型的影響Figure 3 Effect of CXCL5 overexpression on xenograft model of gastric cancer