呂根，嚴(yán)俊，任龍飛，周文策,

0 引言

在我國(guó)，胰腺癌發(fā)病率位居惡性腫瘤的第10位，新發(fā)病例占惡性腫瘤的2.42%；而死亡病例高居腫瘤相關(guān)死亡的第6位[1]。歷年來(lái)胰腺癌的死亡人數(shù)與發(fā)病人數(shù)相當(dāng)[2-3]，發(fā)病隱匿，進(jìn)展迅速，病死率高，預(yù)后差[4]。因此尋找胰腺癌早期篩查分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[5]，孤兒基因是指在系統(tǒng)地層學(xué)中被限制在特定譜系、與其他譜系沒(méi)有相似序列的基因[6]，其表達(dá)多具有時(shí)間特異性和組織特異性，與胚胎發(fā)育、組織分化、罕見(jiàn)疾病和腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生物過(guò)程相關(guān)[7]，孤兒基因中的骨髓瘤過(guò)表達(dá)基因（myeloma overexpressed,MYEOV）與多種腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和臨床預(yù)后相關(guān)，其在胰腺癌研究中尚無(wú)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)MYEOV在胰腺細(xì)胞系中表達(dá)情況，并通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染下調(diào)MYEOV基因表達(dá)水平，探討其對(duì)人胰腺癌細(xì)胞的體外增殖和遷移能力的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人胰腺細(xì)胞株AsPC-1、BxPC-3、Mia Paca-2、SW1990和HPDE6由蘭州大學(xué)第二醫(yī)院陳昊教授惠贈(zèng)，CFPAC-1和PANC-1購(gòu)自上海中科院。RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自以色列Biolnd公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；qPCR引物序列購(gòu)自上海生工生物股份有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒和SYBY Green PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；細(xì)胞裂解及蛋白抽提試劑、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、Western blot配膠試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜、ECL發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；LV-MYEOV-RNAi慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物公司；CCK-8試劑購(gòu)自日本同仁公司；兔抗人MYEOV抗體、鼠抗人GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔、鼠二抗購(gòu)自美國(guó)SAB公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1、BxPC-3用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，CFPAC-1、PANC-1、SW1990、Mia Paca-2和HPDE6用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用含0.25%的胰蛋白酶消化。

1.2.2 慢病毒的設(shè)計(jì)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 設(shè)計(jì)人MYEOV shRNA慢病毒MYEOV-sh，載體為GV248，元件順序hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin，其中MYEOV-sh1序列為：5′-CCGGGCTGACTGTTG TGACTGTTCTCGAGAACAGTCACAACAGTCA GCCATTTTTG-3′，MYEOV-sh2序列為：5′-CCGG GGCTCTCCATGGAAATTATCTCGAGATAATTTC CATGGAGAGCCCATTTTTG-3′，空載體序列為：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW1990細(xì)胞以1.5×105個(gè)每孔接種于6孔板中，12 h當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)40%時(shí)按制造商的指南進(jìn)行感染，MOI值為10。根據(jù)轉(zhuǎn)染狀態(tài)及轉(zhuǎn)染載體不同分為4組：SW1990-NC組為沒(méi)有任何干預(yù)的正常對(duì)照組（Normal control），SW1990-VC組為轉(zhuǎn)染空白載體的陰性對(duì)照組（Vector control），SW1990-sh1和SW1990-sh2為實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染12 h后換液，72 h觀察轉(zhuǎn)染效果，用2 μg/ml嘌呤霉素篩選10天獲得混合穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.2.3 qPCR檢測(cè)MYEOV及TGF-β通路中SMADs RNA水平表達(dá) 將融合度在85%左右的各組細(xì)胞處理后使用TRIzol法提取總RNA，檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒按說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行qPCR反應(yīng)，基因特異性引物序列見(jiàn)表1。qPCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)，預(yù)變性；95℃ 3 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)，引物熔解曲線測(cè)定。使用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算mRNA表達(dá)水平。

1.2.4 Western blot檢測(cè)MYEOV蛋白水平表達(dá) 細(xì)胞融合度達(dá)到85%左右，使用含PMSF、PI的強(qiáng)RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA濃度試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液和適量RIPA將蛋白濃度定量，在95℃ 5 min金屬浴條件下蛋白變性。配制5%濃縮膠和10%分離膠，每孔上樣50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳（濃縮膠80 V 30 min，分離膠120 V 1.5 h，恒壓），200 mA恒流濕轉(zhuǎn)2 h將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用2%BSA室溫?fù)u床封閉1 h，一抗（稀釋比GAPDH 1:2000，MYEOV 1:500）4℃孵育14 h，TBST室溫?fù)u床洗膜3次（每次20 ml,5 min），對(duì)應(yīng)的二抗（稀釋比1:2000）室溫?fù)u床孵育1 h，TBST再次洗膜3次后ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。使用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

表1 qPCR特異性引物序列Table 1 Specific primer sequence of qPCR

1.2.5 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞體外增殖能力 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW1990對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞消化后重懸至1×104個(gè)每毫升，接種于96孔板中，每孔100 μl，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，待3 h細(xì)胞貼壁后棄原培養(yǎng)基，每孔加入100 μl含10%CCK-8溶液的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，孵箱溫育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度。間隔24 h更換96孔板中培養(yǎng)基，分別于24、48、72和96 h使用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞吸光度，使用GraphPad軟件繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 使用胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)每毫升，接種于6孔板，鋪板均勻后恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)90%左右時(shí)，使用10 μl槍頭垂直劃痕，PBS洗3次后加入2 ml無(wú)血清培養(yǎng)基，分別于0 h和24 h在倒置顯微鏡下拍照。用Image J軟件對(duì)各組細(xì)胞遷移面積進(jìn)行分析。劃痕愈合率=（劃痕面積0h-劃痕面積24h）/劃痕面積0h×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0和SPSS18.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)與單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺細(xì)胞系中MYEOV的表達(dá)水平

通過(guò)qPCR和Western blot檢測(cè)胰腺細(xì)胞系中MYEOV mRNA與蛋白的表達(dá)水平。MYEOV mRNA在正常胰腺上皮細(xì)胞HPDE6中表達(dá)水平（1.01±0.09）顯著低于胰腺癌細(xì)胞，在PANC-1和SW1990中表達(dá)水平高（1024.00±20.49和1691.00±84.51），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），其中SW1990細(xì)胞中mRNA表達(dá)最高，見(jiàn)圖1A。而在蛋白表達(dá)水平上，在PANC-1和SW1990細(xì)胞中檢測(cè)到MYEOV蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖1B。因此選擇SW1990細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。

2.2 MYEOV-shRNA轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞后MYEOV的表達(dá)變化

圖1 人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞及6種胰腺癌細(xì)胞系中MYEOV mRNA(A)和蛋白(B)的表達(dá)水平Figure 1 Expression levels of MYEOV mRNA(A) and protein(B) in pancreatic ductal epithelium cell line and six pancreatic cancer cell lines

MYEOV-shRNA轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞后用嘌呤霉素篩選獲得混合穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，提取各組細(xì)胞RNA和蛋白。SW1990-NC與SW1990-VC組比較，MYEOV mRNA和蛋白水平表達(dá)變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.100和P=0.195）；在mRNA水平上，與SW1990-VC組（1.001±0.020）比較，SW1990-sh1組（0.131±0.014）和SW1990-sh2組（0.091±0.001）中MYEOV mRNA表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001和P=0.0005）；在蛋白表達(dá)水平上，與SW1990-NC組（1.056±0.065）和SW1990-VC組（0.918±0.061）比較，SW1990-sh1組（0.558±0.046）和SW1990-sh2組（0.537±0.025）中MYEOV表達(dá)均下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001和P＜0.01），見(jiàn)圖2。

2.3 MYEOV敲低后SW1990細(xì)胞增殖能力的變化

CCK-8法分別比較24、48、72和96 h時(shí)4組細(xì)胞增殖速度，雙因素方差分析，F(xiàn)細(xì)胞組=1148.8,P＜0.001;F時(shí)間=360,P＜0.001;F細(xì)胞組×?xí)r間=31.8,P＜0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別比較各時(shí)間點(diǎn)4組細(xì)胞增殖速度，與SW1990-NC組對(duì)比，SW1990-VC組細(xì)胞增殖速度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（24 h時(shí)P=0.018，余P＜0.01）；與SW1990-VC組比較，SW1990-sh1和SW1990-sh2組細(xì)胞增殖速度均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（SW1990-sh1組P＜0.01，SW1990-sh2組P＜0.001）；與SW1990-sh1組相比，SW1990-sh2組細(xì)胞增殖速度更慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

2.4 MYEOV敲低后SW1990細(xì)胞遷移能力的變化

圖2 MYEOV-shRNA轉(zhuǎn)染后SW1990細(xì)胞中MYEOV mRNA(A)和蛋白(B,C)的表達(dá)水平Figure 2 Expression levels of MYEOV mRNA(A) and protein(B,C) in SW1990 cells after MYEOV-shRNA lentivirus infection

圖3 MYEOV敲低對(duì)SW1990細(xì)胞增殖能力的影響Figure 3 Effect of MYEOV knockdown on proliferation of SW1990 cells

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SW1990細(xì)胞遷移能力變化，單因素方差分析劃痕愈合率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=272.2,P＜0.001）。與SW1990-NC組（90.95±2.515）%和SW1990-VC組（76.21±0.532）%相比，SW1990-sh1組（45.38±1.985）%和SW1990-sh2組（20.82±2.808）%的劃痕愈合率均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與SW1990-sh1組相比，SW1990-sh2組劃痕愈合率更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0009），見(jiàn)圖4。

2.5 MYEOV-shRNA轉(zhuǎn)染SW1990后細(xì)胞TGF-β/SMAD通路中SMADs的mRNA表達(dá)

使用qPCR檢測(cè)4組細(xì)胞中SMADs mRNA的表達(dá)水平變化。與SW1990-VC組相比，SMAD1、SMAD5和SMAD9 mRNA在SW1990-sh1組和SW1990-sh2組中表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；SMAD4 mRNA在兩實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031和P=0.007）；而SMAD2、SMAD3和SMAD7 mRNA僅在SW1990-sh2中表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但在SW1990-sh1組中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖5。

3 討論

骨髓瘤過(guò)表達(dá)基因（MYEOV）是人類(lèi)孤兒基因中第一個(gè)被確定的致癌性基因[8-9]，分布在染色體11q13上，雖然在猩猩、猴等其他類(lèi)人猿物種中也存在MYEOV基因但并未發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄和翻譯，而非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的癌癥發(fā)病率非常低，因此MYEOV對(duì)于研究人類(lèi)惡性腫瘤高發(fā)病率具有重要意義[10]。MYEOV在食管癌[11]、胃癌[12]、乳腺癌[13]、結(jié)直腸癌[14-15]、非小細(xì)胞肺癌[16-17]、多發(fā)性骨髓瘤[18-19]等腫瘤中高表達(dá)，參與調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、侵襲等過(guò)程，與患者預(yù)后關(guān)系密切。通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)MYEOV在胰腺癌中高表達(dá)，與胰腺癌預(yù)后相關(guān)，提示MYEOV可能參與胰腺的惡性生物過(guò)程[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，相比于正常胰腺上皮細(xì)胞HPDE6，MYEOV mRNA在胰腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)；胰腺癌細(xì)胞系中，在PANC-1和SW1990兩株細(xì)胞中檢測(cè)出MYEOV蛋白表達(dá)，提示MYEOV蛋白的翻譯過(guò)程可能受到其過(guò)長(zhǎng)的5'-UTR高度抑制[21]，MYEOV蛋白的表達(dá)可能是通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的非帽依賴(lài)性機(jī)制進(jìn)行的[22-23]。MYEOV mRNA和蛋白表達(dá)差異的現(xiàn)象也存在于食管癌[11]、胃癌[12]、結(jié)直腸癌[14]、非小細(xì)胞肺癌[17]中，因此MYEOV的翻譯機(jī)制及真核生物的非帽依賴(lài)性翻譯機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

為探討MYEOV在胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移中的作用及可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定的MYEOV表達(dá)下調(diào)細(xì)胞系SW1990，通過(guò)qPCR和Western blot檢測(cè)MYEOV表達(dá)下調(diào)后，SW1990細(xì)胞增殖和遷移能力明顯下降，而且在SW1990-sh1和SW1990-sh2兩實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞增殖和遷移能力之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究檢測(cè)了TGF-β/SMAD信號(hào)通路中部分基因的mRNA表達(dá)情況，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中SMAD1、SMAD5和SMAD9表達(dá)明顯下調(diào)，而SMAD2、SMAD3和SMAD7僅在SW1990-sh2組中明顯下調(diào)。在TGF-β通路中，SMAD2、SMAD3在細(xì)胞外基質(zhì)形成、血管生成等過(guò)程起重要作用[25]，其表達(dá)及其磷酸化形成RSMAD/coSMAD復(fù)合物進(jìn)入核是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。SMAD2、SMAD3在兩實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)差異可能是兩組細(xì)胞增殖和遷移能力差異的原因。

MYEOV在惡性腫瘤中的作用機(jī)制尚不清楚，有研究表明在非小細(xì)胞肺癌中MYEOV mRNA可直接作為ceRNA通過(guò)TGF-β通路調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和小鼠體內(nèi)成瘤過(guò)程[17]。TGF-β信號(hào)通路具有抑制腫瘤發(fā)生和促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的雙重拮抗性效應(yīng)，更與腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化息息相關(guān)[24-25]。TGF-β抑制劑是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一，一些TGF-β抑制劑在臨床試驗(yàn)中使部分晚期腫瘤獲益[26]，因此對(duì)MYEOV的研究可能為尋找新的TGF-β抑制劑提供思路。

綜上所述，MYEOV mRNA在胰腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)，下調(diào)MYEOV表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，其調(diào)節(jié)機(jī)制可能與TGF-β通路中SMADs表達(dá)下調(diào)有關(guān)。然而，MYEOV在腫瘤中的翻譯機(jī)制以及相關(guān)的調(diào)控機(jī)制目前仍不完全清楚，因此全面深入了解MYEOV在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，對(duì)于尋找胰腺癌早診及治療的新靶點(diǎn)有重要意義。