陳哲文，石漢平，繆明永，余亞英，張啟瑜

0 引言

隨著腫瘤營養(yǎng)學的興起，通過特殊飲食抗腫瘤的營養(yǎng)療法越來越受到關(guān)注[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，甘露糖能夠抑制腫瘤的生長，增強化療藥物的效果，不同腫瘤敏感度的差異與甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶（mannose-6-phosphate isomerase,PMI）的表達有關(guān)[2]。

腫瘤細胞以有氧糖酵解為主要能量來源，糖酵解速度遠高于正常組織，稱為Warburg效應(yīng)[3]。降低血糖，減少葡萄糖供應(yīng)，理論上可以特異性阻斷腫瘤細胞的能量來源，從而抑制腫瘤細胞的生長。禁食及能量限制的飲食方式均能夠降低機體葡萄糖水平，從而起到抗腫瘤的效果[1]。同時，低糖環(huán)境可能會增強如二甲雙胍等藥物的抗腫瘤作用[4-5]，甘露糖的抗腫瘤作用與糖代謝密切相關(guān)，降低培養(yǎng)基的葡萄糖濃度可能增強腫瘤細胞對甘露糖的敏感度。

本研究通過體內(nèi)與體外實驗，觀察不同葡萄糖濃度處理下的胰腺腫瘤細胞的增殖與PMI蛋白表達的變化，在荷瘤鼠模型中選擇高脂低糖的生酮飲食來降低裸鼠血糖水平，探討生酮飲食（ketogenic diet,KD）與甘露糖聯(lián)合應(yīng)用的抗腫瘤療效。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人胰腺癌細胞AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、SW1990均購自中國科學院上海細胞庫，用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和100 u/ml的青霉素、100 μg/ml鏈霉素，美國Gibco公司，C11995500BT）培養(yǎng)于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，隔天換培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化傳代。

1.2 細胞增殖檢測

將2×103個AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、SW1990胰腺癌細胞分別接種于不同的96孔板中，細胞貼壁后，更換不同濃度葡萄糖（25、10、2.5 mmol/L）的培養(yǎng)基并加入濃度梯度的甘露糖（Sigma-Aldrich,M2069），每組重復(fù)3次，培養(yǎng)4天（每2天更換培養(yǎng)基）后加入10 μl CCK-8溶液（同仁，CK04)，并于培養(yǎng)箱中孵育2 h后以酶標儀測定450 nm處的吸光度。

1.3 蛋白印跡實驗（Western blot）

以RIPA蛋白裂解液（上海碧云天，P0013）提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，4:1加入蛋白上樣緩沖液沸水浴變性5 min，印跡到PVDF膜（美國Millipore,IPVH00010）上。使用PMI的特異性抗體（美國Proteintech,14234-1-AP）和β-actin（上海雅酶生物，LF202）4℃孵育過夜后，兔二抗（上海雅酶生物，LF102）常溫2 h，ECL化學發(fā)光法曝光條帶。

1.4 細胞存活率檢測

將2×104個細胞接種于12孔板中，各孔板含不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基，實驗組含有25 mmol/L甘露糖，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按錐蟲藍染色細胞存活率檢測試劑盒（上海碧云天，C0011）說明書操作，并用細胞計數(shù)儀（Nexcelom Cellometer Auto 2000）測各組細胞存活率。

1.5 裸鼠皮下移植瘤模型建立及干預(yù)

32只裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，取對數(shù)生長期的胰腺癌細胞BxPc-3，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為2×106個/200微升[6]，將細胞懸液200 μl接種于裸小鼠的右后支背部皮下。當腫瘤體積約100 mm3時，用游標卡尺測量腫瘤直徑，用公式V=ab2π/6（a為最長直徑，b為最短直徑）計算腫瘤體積，并隨機分成四組：正常飲食（standard diet,SD）組、SD+甘露糖（mannose,Man）組、KD（深圳奇酮公司）組以及KD+Man組，其中Man組與KD+Man組分別以飲用水配制20%和10%甘露糖水溶液的方式喂養(yǎng)。根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，KD組用量為125 g/kg，SD組不限量，小鼠每日攝取的總能量相近，SD與KD組具體營養(yǎng)配比見表1。實驗過程中使用雅培血糖儀尾靜脈取血檢測血糖、血酮水平。

表1 正常飲食組與生酮飲食組飲食營養(yǎng)配比Table 1 Diet nutrition proportion of SD and KD groups

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS23.0和Graphpad Prism 8.2軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料數(shù)據(jù)用（>）表示，配對樣本t檢驗比較瘤重和血糖血酮水平。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 低糖增強甘露糖對胰腺癌細胞的抑制作用

葡萄糖濃度為2.5 mmol/L時，較低濃度的甘露糖顯著抑制胰腺癌細胞增殖，而葡萄糖濃度為25與10 mmol/L時細胞增殖被顯著抑制所需的甘露糖濃度更高，見圖1A～B。25和10 mmol/L葡萄糖濃度時，PANC-1與SW1990細胞對甘露糖敏感度較低，而在2.5 mmol/L葡萄糖濃度時，細胞增殖抑制效果明顯（與加入25 mmol/L甘露糖時的抑制率比較，C:P25=0.095,P10=0.029,P2.5=0.014; D:P25=0.008,P10=0.003,P2.5=0.001），見圖1C～D。

2.2 低糖下調(diào)PMI酶蛋白的誘導(dǎo)表達

圖1 低糖增加甘露糖對胰腺癌細胞的抑制作用Figure 1 Low glucose increased inhibitory effect of mannose on pancreatic cancer cells

Western blot實驗結(jié)果顯示，不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，AsPC-1細胞系的PMI酶基礎(chǔ)表達量無明顯差異。甘露糖能誘導(dǎo)AsPC-1細胞系PMI酶的表達，而且在25 mmol/L葡萄糖濃度時的誘導(dǎo)效果明顯強于10、2.5 mmol/L葡萄糖濃度，見圖2A。葡萄糖濃度較低時，BxPc-3細胞系PMI酶的基礎(chǔ)表達上調(diào)，甘露糖對酶的誘導(dǎo)效果在高糖時更顯著，見圖2B。

圖2 不同葡萄糖濃度作用下PMI蛋白表達的變化Figure 2 Changes of PMI expression under different concentrations of glucose

2.3 低糖與甘露糖協(xié)同作用降低胰腺癌細胞存活率

加入25 mmol/L甘露糖后，胰腺癌細胞在不同葡萄糖培濃度養(yǎng)基中鋪板的存活率均有所降低，且低糖下細胞存活率明顯低于高糖下的存活率，見圖3（A:P25=0.004,P10=0.036,P2.5=0.009;B:P25=0.003,P10=0.03,P2.5=0.004; C:P25=0.013,P10=0.015,P2.5=0.0009; D:P25=0.013,P10=0.042,P2.5=0.006）。

2.4 生酮飲食能降血糖、升血酮且與甘露糖協(xié)同抑制胰腺癌移植瘤

生酮飲食顯著降低裸鼠的血糖（使血糖維持在2～3 mmol/L），升高血酮水平，（使血酮維持在1.5～2.5 mmol/L），而正常血糖與血酮水平分別在6 mmol/L左右與1 mmol/L以下，見圖4A～B。甘露糖則對血糖與血酮水平無明顯作用（預(yù)實驗證明甘露糖不干擾血糖檢測）。干預(yù)18 d后，因KD+Man組裸鼠體重較低停止實驗，KD組幾乎無抑瘤效果（P=0.44），Man組腫瘤明顯較小（P=0.0247），而KD+Man組腫瘤顯著小于其他三組（PSD＜0.0001,PKD＜0.0001,PMan=0.0061），見圖4C～E。

3 討論

腫瘤的營養(yǎng)代謝療法是一種新興的癌癥治療方法，利用腫瘤細胞不同于體細胞的代謝特點，采取能量限制等方式干擾腫瘤的代謝，從而達到抑制腫瘤生長或提高抗腫瘤一線療法效果的目的[7]。

圖3 低糖聯(lián)合甘露糖降低胰腺癌細胞存活率Figure 3 Mannose combined with low glucose reduced viability of pancreatic cancer cells

圖4 生酮飲食與甘露糖協(xié)同抑制移植瘤生長Figure 4 Ketogenic diet and mannose synergistically inhibited growth of xenografts

圖5 葡萄糖和甘露糖代謝途徑Figure 5 Metabolism pathways of glucose and mannose

甘露糖是一種廣泛存在于自然界中的單糖，也是葡萄糖、半乳糖C-2位羥基的差向異構(gòu)體，與葡萄糖具有相同的轉(zhuǎn)運體[8]，在人體代謝中具有重要作用，一些先天性糖基化障礙與甘露糖代謝相關(guān)酶的突變有關(guān)[9]。PMI的缺失會促進人肝星狀細胞激活纖維化反應(yīng)，調(diào)節(jié)甘露糖代謝途徑可以減少人肝星狀細胞活化并改善肝纖維化的預(yù)后[10]。D-甘露糖補充劑還能夠改善小鼠模型自身免疫性糖尿病和氣道炎性反應(yīng)，并增加Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的比例[11]，且有助于預(yù)防復(fù)發(fā)性尿路感染[12]。有研究發(fā)現(xiàn)甘露糖還具有抑制腫瘤、提高化療藥物療效的作用。甘露糖通過葡萄糖轉(zhuǎn)運載體進入細胞內(nèi)，然后被己糖激酶（HK）磷酸化為甘露糖-6-磷酸（M-6-P），并通過PMI催化與果糖-6-磷酸相互轉(zhuǎn)化。細胞將已糖作為一個整體來調(diào)節(jié)，在PMI活性較低的腫瘤細胞中，M-6-P的積累會負反饋抑制葡萄糖代謝關(guān)鍵的三種酶活性：HK、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，從而影響腫瘤細胞葡萄糖代謝（見圖5）抑制腫瘤生長[13-15]。也有研究表明，甘露糖受體參與腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）的活化，而TAM具有抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及殺傷腫瘤細胞的功能[16-17]。同時，有研究發(fā)現(xiàn)甘露糖能夠調(diào)控調(diào)節(jié)性T細胞的活性，在免疫平衡調(diào)節(jié)過程發(fā)揮重要的作用，其抗腫瘤的機制也可能與增強免疫系統(tǒng)識別并殺死腫瘤細胞的能力有關(guān)[18]。

人體正常血糖濃度為3.9～6.1 mmol/L，遠低于通常細胞培養(yǎng)的25 mmol/L，因為甘露糖通過生成M-6-P負反饋抑制葡萄糖磷酸化的進行，高糖環(huán)境不僅為腫瘤提供了更佳的生存環(huán)境，更多葡萄糖底物的存在也可能減弱了甘露糖的效應(yīng)，使腫瘤細胞表現(xiàn)為對甘露糖不敏感。高脂低糖的生酮飲食本身即具有一定的抗腫瘤療效，且進一步降低了機體的血糖值，可能與甘露糖具有協(xié)同效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，低糖與甘露糖具有協(xié)同作用，聯(lián)合應(yīng)用增強了甘露糖抗腫瘤的效果。甘露糖抑制腫瘤的敏感度與PMI酶的表達密切相關(guān)，在PMI酶高表達的腫瘤中甘露糖的作用有限。細胞實驗中，正常高糖培養(yǎng)條件下加入甘露糖能夠明顯誘導(dǎo)細胞PMI酶的表達，隨著培養(yǎng)基葡萄糖濃度的降低，甘露糖底物對PMI酶的誘導(dǎo)作用減弱，從而增強了甘露糖對腫瘤細胞的抑制效果。體內(nèi)實驗中，生酮飲食加10%甘露糖聯(lián)合應(yīng)用組能抑制荷瘤鼠腫瘤生長，且效果優(yōu)于20%甘露糖或者生酮飲食的單獨應(yīng)用。然而聯(lián)合應(yīng)用組荷瘤鼠的平均體重明顯降低，我們猜想可能是體細胞PMI酶的誘導(dǎo)表達也同時被抑制，M-6-P在體細胞中堆積，影響了機體正常葡萄糖的利用，也有可能攝入甘露糖影響了體細胞對酮體的利用。同時，體內(nèi)實驗中荷瘤鼠血糖降低水平遠不如細胞實驗，其中可能還存在其他的機制發(fā)揮作用。我們新的實驗結(jié)果表明酮體本身對PMI酶的表達起到一定抑制作用，可能與βHB作為信號分子的作用有關(guān)[19-20]。進一步的實驗證據(jù)正在探索當中。接下來的實驗中我們將研究酮體與PMI酶、甘露糖與酮體酶表達之間的相互作用關(guān)系，摸索甘露糖水溶液與生酮飲食聯(lián)合應(yīng)用的最適濃度，同時觀察聯(lián)合喂養(yǎng)對小鼠進食、消化能力與腸道代謝物的影響，為該方法的腫瘤臨床治療提供更多的依據(jù)。