賈棟 ，紀(jì)周瑜 ，劉艷紅 ，袁曉芳 ，張彬 ，馬瑞燕 *

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801）

基因表達(dá)分析在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮越來越重要的作用。常用的基因表達(dá)分析技術(shù)包括Northern 印跡、實(shí)時(shí)定量 PCR（Quantitative realtime PCR，qPCR）、基因芯片、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等方法。在這些技術(shù)中，qPCR 被認(rèn)為是分析特定基因表達(dá)的首選方法，由于其高度的靈敏性、準(zhǔn)確性、特異性和快速性而被眾多研究者廣泛使用［1，2］。即便使用基因芯片或測(cè)序等高通量方法進(jìn)行研究，往往還需要qPCR 對(duì)研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。然而qPCR數(shù)據(jù)的真實(shí)可靠性常受到內(nèi)參基因、模板質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增效率等因素的影響，關(guān)乎研究基因的差異表達(dá)判斷的準(zhǔn)確性［3，4］。因此，為了減少試驗(yàn)誤差，選擇合適的qPCR 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法至關(guān)重要，但也存在很多困難［4，5］。使用穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因是目前最常用的qPCR 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法之一，特別是使用2-ΔΔCt方法時(shí)，內(nèi)參基因的選擇尤為重要［4，6］。

理想的內(nèi)參基因應(yīng)該不受實(shí)驗(yàn)過程和條件的影響，具有高表達(dá)，并且在不同處理和組織中表現(xiàn)出相似的、穩(wěn)定的表達(dá)水平［7］。一些傳統(tǒng)的看家基因被認(rèn)為在任何實(shí)驗(yàn)條件下都是穩(wěn)定表達(dá)的，常被研究者用作內(nèi)參基因，例如β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和18S 核糖體 RNA（18S rRNA）［8，9］。然而，研究已經(jīng)證明這些被廣泛使用的看家基因在不同實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)是存在差異的，用于qPCR 數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［10，11］，可以認(rèn)為沒有任何一種內(nèi)參基因適用于所有細(xì)胞、組織類型以及試驗(yàn)條件［12］。此外，內(nèi)參基因的數(shù)量對(duì)qPCR 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化也有影響［11］。因此，qPCR 試驗(yàn)研究前內(nèi)參基因的 篩 選 評(píng) 估 是 至 關(guān) 重 要 的 。 ΔCt［13］、geNorm［4］、NormFinder［14］和 BestKeeper［15］4 種 程 序 經(jīng) 常 被 用來評(píng)估確定合適的內(nèi)參基因，基于網(wǎng)絡(luò)的在線工具 RefFinder［16］集 成了以上 4 個(gè) 程序用來綜 合 評(píng)估最適內(nèi)參基因。

蓮草直胸跳甲Agasicles hygrophilaSelman &Vogt，原產(chǎn)于南美洲阿根廷，是世界范圍內(nèi)惡性入侵雜草喜旱蓮子草Alternanthera philoxeroides的專食性天敵昆蟲［17，18］。蓮草直胸跳甲的生態(tài)適應(yīng)性與寄主專一性的分子機(jī)制一直是本課題組感興趣的研究方向，常涉及相關(guān)基因的表達(dá)分析，前期研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)參基因的不穩(wěn)定表達(dá)常常會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤判。本研究中，筆者從昆蟲學(xué)的一些經(jīng)典期刊論文中選取了9 個(gè)常用的候選內(nèi)參基因：β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、核糖體蛋白 L13a（RPL13a）、18S 核糖體蛋白（RPS18）、泛素（UBC）、α 延伸因子（EF-1α）、核糖體蛋白 S6（RPS6）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）、α-微管蛋白（α-Tubulin）與β-微管蛋白（β-Tubulin），評(píng)估了這些基因在蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段的表達(dá)穩(wěn)定性，以確定蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段的最適內(nèi)參基因，用蓮草直胸跳甲小分子熱激蛋白基因shsp20.8進(jìn)一步驗(yàn)證內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。本研究首次對(duì)蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段的內(nèi)參基因進(jìn)行了篩選，為后續(xù)相關(guān)基因表達(dá)分析提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

蓮草直胸跳甲最初采集于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，之后種群在標(biāo)準(zhǔn)化條件（25℃±1℃，L∶D=14∶10，RH=85%±5%）下飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)蟲室達(dá)10 年以上，因此種群具有相似的遺傳背景。用于飼養(yǎng)供試?yán)ハx的喜旱蓮子草采自浙江省玉環(huán)市，現(xiàn)種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全與生物防治研究基地溫室中。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 昆蟲樣品收集

為使試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，試驗(yàn)前對(duì)蓮草直胸跳甲的卵進(jìn)行了同步化，即卵塊均為3 h 內(nèi)所產(chǎn)。不同發(fā)育階段的取樣分別為：1 日齡卵，1 日齡的1、2、3 齡幼蟲，2 日齡蛹和1 日齡成蟲。所取樣品均在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，3 次重復(fù)。收集不同發(fā)育階段樣品液氮速凍后存放于-80℃冰箱備用。

1.2.2 RNA 提取 與 cDNA 合成

蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段的樣品使用TRIzol 試 劑（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA），參照說明書操作方法提取總RNA。Bio-Photometer Plus（Eppendorf，Hamburg，Germany）測(cè)定其濃度和純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 的完整性。使用PrimeScript ?試劑盒（Perfect Real Time）（TaKaRa，Dalian，china）合成cDNA，用于 qPCR 分析。

1.2.3 基因選擇與引物設(shè)計(jì)

蓮草直胸跳甲9 個(gè)候選內(nèi)參基因（β-actin、RPL13a、RPS18、UBC、EF-1α、RPS6、GAPDH、α-Tubulin、β-Tubulin）的序列均從前期已完成的三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中獲取，并經(jīng)過序列比對(duì)分析確認(rèn)。shsp20.8基因序列前期已克隆鑒定并提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫（MN685581），引物設(shè)計(jì)使用在線軟件 primer3（http：//primer3.ut.ee）完成，引物具體信息見表1，在進(jìn)行qPCR 前先通過RT-PCR進(jìn)行引物特異性驗(yàn)證。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR

qPCR 所使用的儀器為 ABI 7500（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA），試 劑 為SYBR Green Realtime PCR Master Mix（Toyobo，Osaka，Japan），qPCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 2 min，之后 95 ℃變性 15 s，60 ℃退火 15 s，72 ℃延伸30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。然后通過 60 ℃至 95 ℃熔解曲線檢測(cè)是否存在非特異性擴(kuò)增和引物二聚體。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用 ΔCt、geNorm、NormFinder 和 BestKeeper4 種程序綜合評(píng)估9 個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，通過geNorm 的配對(duì)差異值Vn/Vn+1 以確定最佳內(nèi)參基因數(shù)目，閾值為0.15。以shsp20.8為靶基因?qū)?nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù) 均 采 用 2-ΔΔCt法 分 析 處 理［19］。 試 驗(yàn) 數(shù) 據(jù) 通 過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），使用 Tukey’s HSD 算法，差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。所有的柱狀圖均由SigmaPlot 12.5 繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性分析

蓮草直胸跳甲候選內(nèi)參基因的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖1 所示，均得到預(yù)期片段的單一條帶。9個(gè)內(nèi)參基因qPCR 的熔解曲線均顯示為單一、清晰的峰，沒有其他雜峰（圖2）。這表明每對(duì)引物擴(kuò)增出單一的產(chǎn)物，沒有其他非特異產(chǎn)物和引物二聚體。

2.2 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

9 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性由ΔCt、geNorm、NormFinder 和BestKeeper 4 種程序來評(píng)估分析，具體4 種程序的算法在其文獻(xiàn)中均有詳細(xì)描述［4，13～15］。分析結(jié)果表明 BestKeeper 分析的基因穩(wěn)定性排名與其他3 種方法差異較大，RPS18、RPL13a、RPS6基因在 ΔCt、geNorm、NormFinder的穩(wěn)定分析中均排名前三，而只有RPS18在Best-Keeper 計(jì)算的結(jié)果中排名前三。RefFinder 計(jì)算的綜合排名為：RPS18＞RPL13a＞RPS6 ＞β-actin ＞α-Tubulin ＞UBC ＞β-Tubulin ＞GAPDH ＞EF-1α（表 2）。

表1 qPCR 靶基因和內(nèi)參基因引物Table 1 Primer pairs used for qPCR analysis of target and reference genes

圖1 蓮草直胸跳甲9 個(gè)候選內(nèi)參基因RT-PCR 產(chǎn)物檢測(cè)Fig.1 Detection of RT-PCR products of 9 candidate reference genes in A.hygrophila

表2 蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 2 Stability of reference gene expression at different developmental stages of A.hygrophila

2.3 最佳內(nèi)參基因數(shù)目的確定

圖2 候選內(nèi)參基因的熔解曲線Fig.2 Melt curves of candidate reference genes

在基因的表達(dá)研究中，通常需要2 個(gè)及以上內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以減少誤差。geNorm 是確定所需內(nèi)參基因數(shù)目的常用軟件，該方法通過配對(duì)差異值Vn/Vn+1 確定最佳內(nèi)參基因數(shù)，軟件說明書推薦V 閾值為0.15，當(dāng)V 值低于0.15 即沒有必要增加內(nèi)參基因的數(shù)量，即最佳內(nèi)參基因的數(shù)量為n。本研究所有的配對(duì)差異值Vn/Vn+1 均小于0.15，因此選擇需要2 個(gè)（V2/V3）內(nèi)參基因共同標(biāo)準(zhǔn)化qPCR 數(shù)據(jù)，根據(jù)上述穩(wěn)定性排序選擇RPS18和RPL13a作為最佳內(nèi)參基因組合（圖3）。

2.4 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)所選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，使用不同內(nèi)參基因評(píng)估了蓮草直胸跳甲shsp20.8基因在各發(fā)育階段的表達(dá)模式。使用最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合（RPS18和RPL13a）、最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因（EF-1α）分別標(biāo)準(zhǔn)化shsp20.8表達(dá)數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，不同發(fā)育階段shsp20.8基因的表達(dá)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（P＜ 0.05），均在卵期和蛹期表達(dá)量最高，其它發(fā)育階段表達(dá)較低。但是，當(dāng)使用RPS18和RPL13a標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)時(shí)，蓮草直胸跳甲shsp20.8的表達(dá)量在卵期最高（表達(dá)量是成蟲期的20 倍），而使用EF-1α標(biāo)準(zhǔn)化shsp20.8的表達(dá)量在蛹期最高（表達(dá)量是成蟲期的45 倍）（圖4）。因此，使用上述不同內(nèi)參基因分別標(biāo)準(zhǔn)化目的基因shsp20.8的表達(dá)譜數(shù)據(jù)會(huì)獲得不同的試驗(yàn)結(jié)果。

圖3 蓮草直胸跳甲數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化最佳內(nèi)參基因組合Fig.3 The optimal combination of reference genes for normalization in A.hygrophila

3 討論與結(jié)論

圖4 蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段不同內(nèi)參基因shsp20.8 的表達(dá)Fig.4 Expression levels of shsp20.8 at different developmental stages of A. hygrophila using various reference genes for normalization

qPCR 是基因表達(dá)研究中最常使用的技術(shù)，但需要使用穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化以減少實(shí)驗(yàn)誤差?，F(xiàn)在越來越多的研究表明，沒有單一的通用基因在所有實(shí)驗(yàn)條件下都能穩(wěn)定表達(dá)，用于 qPCR 數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化［11，20］。但是諸多研究者未經(jīng)評(píng)估驗(yàn)證便使用一些常用的看家基因，有文獻(xiàn)報(bào)道，在近90%的高影響因子期刊上未經(jīng)驗(yàn)證便使用了ACTB和GAPDH作為內(nèi)參基因［10］。

本 研 究 通 過 ΔCt、geNorm、NormFinder 和BestKeeper 4 個(gè)程序綜合評(píng)估分析了9 個(gè)內(nèi)參基因在蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段的表達(dá)穩(wěn)定性。分析結(jié)果顯示，不同算法的分析結(jié)果存在差異，ΔCt、geNorm、NormFinder 得到了較為相似的排名，RPS18、RPL13a、RPS6三 個(gè) 基 因 均 位 列 前 三 ，GAPDH和EF-1α均 排 名最后 2 位 ，與 RefFinder計(jì)算的綜合排名一致。然而，BestKeeper 穩(wěn)定性排名與上述3 種算法差異較大。在東亞飛蝗內(nèi)參基因的篩選中也發(fā)現(xiàn)BestKeeper 的分析結(jié)果不同于其它算法的類似情況［21］。

在二化螟［22］、東亞飛蝗［21］與西花薊馬［23］內(nèi)參基因的評(píng)估中認(rèn)為，EF-1α是不同發(fā)育階段較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。本文研究結(jié)果表明，蓮草直胸跳甲最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镽PS18、RPL13a，而EF-1α為最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因，該結(jié)果也直接證實(shí)在不同昆蟲的發(fā)育階段內(nèi)參基因是不同的。內(nèi)參基因的穩(wěn)定性因昆蟲組織、發(fā)育階段、物種和各種非生物脅迫條件的不同而不同，Shakeel 等［20］在 qPCR 內(nèi)參基因在昆蟲基因表達(dá)的研究進(jìn)展中也有較為詳細(xì)論述。因此筆者建議，在qPCR 之前應(yīng)驗(yàn)證內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，并使用多個(gè)內(nèi)參基因以獲得準(zhǔn)確結(jié)果。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證內(nèi)參基因的穩(wěn)定性對(duì)qPCR基因表達(dá)分析結(jié)果的影響，本文分析了shsp20.8在蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)使用最穩(wěn)定和最不穩(wěn)定內(nèi)參基因?qū)?shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果存在明顯差異。因此，選擇合適穩(wěn)定的內(nèi)參基因是準(zhǔn)確評(píng)估靶基因表達(dá)的關(guān)鍵。綜上所述，本研究確定了蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段的最適內(nèi)參基因RPS18和RPL13a，為今后相關(guān)基因的表達(dá)研究奠定了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為內(nèi)參基因的篩選評(píng)估提供方法參考。