梁華，王燕，朱明雪，郭慧，閆起，西旺，李奇瑋，李澤光

金匱腎氣丸及六味地黃丸對自然衰老小鼠血漿代謝物的影響

梁華，王燕，朱明雪，郭慧，閆起，西旺，李奇瑋，李澤光

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

比較研究金匱腎氣丸及六味地黃丸對自然衰老小鼠血漿代謝物的影響，分析代謝通路富集情況。采用基于超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)的代謝組學(xué)方法，經(jīng)多元統(tǒng)計分析，將質(zhì)譜同位素分析與數(shù)據(jù)庫檢索相結(jié)合鑒定衰老相關(guān)生物標(biāo)志物，通過MetPA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建其代謝通路。隨增齡改變，小鼠體內(nèi)物質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂，在篩選的16個與增齡密切相關(guān)的代謝物中，金匱腎氣丸回調(diào)15個物質(zhì)，六味地黃丸回調(diào)14個物質(zhì)，兩方可共同顯著回調(diào)D-赤蘚糖-4-磷酸、二十二碳六烯酸、脫氧羥腐胺賴氨酸、鳥氨酸和16B-羥基四氮唑5個物質(zhì)，從而影響戊糖磷酸途徑、不飽和脂肪酸的生物合成、谷胱甘肽代謝、精氨酸和脯氨酸代謝途徑。金匱腎氣丸及六味地黃丸均可通過影響氨基酸、糖類和脂肪酸代謝來調(diào)整自然衰老引起的代謝紊亂。

金匱腎氣丸；六味地黃丸；代謝組學(xué)；衰老；小鼠

腎藏精，主生長發(fā)育和生殖，人體生命過程中生、長、壯、老、已不同階段生理狀態(tài)取決于腎中精氣的盛衰變化。腎氣由腎精所化，腎陽為一身陽氣之本，腎陰為一身陰氣之源，故《景岳全書》曰：“五臟之陽氣非此不能發(fā)，五臟之陰氣非此不能滋?！蹦I陽充盛，腎陰充足，對人體臟腑生理功能維持至關(guān)重要。六味地黃丸是經(jīng)典補(bǔ)腎滋陰方劑，金匱腎氣丸是補(bǔ)腎陽的經(jīng)典名方?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，兩方均有調(diào)節(jié)生長發(fā)育、延緩機(jī)體衰老作用，其機(jī)理大多與改善自由基代謝、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)及調(diào)節(jié)免疫等相關(guān)[1-2]。目前，對于兩首經(jīng)典補(bǔ)益方劑作用機(jī)制研究多偏重單方對機(jī)體某些系統(tǒng)的影響，從中醫(yī)整體多靶點調(diào)節(jié)角度及兩方作用之異同的比較研究較少。

代謝組學(xué)通過測定代謝物組成變化，了解機(jī)體代謝網(wǎng)絡(luò)在不同狀態(tài)下變化規(guī)律，與中醫(yī)學(xué)整體觀一致，適于中醫(yī)方劑復(fù)雜體系研究[3]。本課題組基于超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/ MS）方法，探尋兩首補(bǔ)益方劑分別對衰老小鼠體內(nèi)相關(guān)代謝差異物及通路的影響，旨在為補(bǔ)陰補(bǔ)陽方劑延緩衰老作用機(jī)理及陰陽關(guān)系研究提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級ICR雄性小鼠40只，3月齡，體質(zhì)量（42±2）g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（遼）2010-0001，實驗前小鼠于代謝籠內(nèi)適應(yīng)環(huán)境1周，飼養(yǎng)于室溫（22±2）℃、相對濕度（55%±20%）環(huán)境，自由攝食飲水，飼料由哈爾濱市南崗區(qū)玉英養(yǎng)殖廠提供。本實驗經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實驗動物倫理委員會審查批準(zhǔn)（2014120101）。

1.2 藥物

金匱腎氣丸（干地黃 24 g，山藥12 g，山萸肉12 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g，桂枝3 g，炮附片3 g），六味地黃丸（熟地黃24 g，山萸肉12 g，山藥12 g，澤瀉9 g，牡丹皮9 g，茯苓9 g），上述飲片購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。藥物浸泡后分別加8倍量水，文火煮沸，持續(xù)30 min，提取液過濾，藥渣再加6倍量水煎煮，沸騰后持續(xù)30 min，提取液過濾，混合2次濾液，80 ℃、0.09 MPa減壓濃縮回收溶劑至100 mL，金匱腎氣丸配制成濃度為每毫升含0.81 g原藥材藥液，六味地黃丸配制成濃度為每毫升含0.75 g原藥材藥液。

1.3 試劑

生理鹽水（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司），屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司），色譜甲醇（美國賽默飛世爾公司），色譜乙腈（美國賽默飛世爾公司），甲酸（北京迪馬科技?xì)W泰科技發(fā)展中心）。

1.4 儀器

電子分析天平AL204（上海梅特勒托利多儀器有限公司），微量移液器（上海新漢計量器具技術(shù)研究所），KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)（中國科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司），超低溫冰箱（德國賽默飛世爾科技公司），Acquity UPLCTMBEHC18色譜柱，液相Waters Acquity UPLC（美國Waters公司），質(zhì)譜Waters LCT Premier XETOF（美國Waters公司），工作站MassLynxV4.1（美國Waters公司）。

2 實驗方法

2.1 分組和給藥

隨機(jī)選取小鼠10只為青年組。其余30只正常單籠飼養(yǎng)至20月齡，隨機(jī)分為老齡組、金匱腎氣丸組和六味地黃丸組，每組10只，每日8:30－9:00灌胃給藥，根據(jù)種屬間等效計量換算小鼠和人的系數(shù)為0.002 6，計算得出給藥體積為每日13 mL/kg（金匱腎氣丸給藥量10.53 g/kg，六味地黃丸給藥量9.75 g/kg）。青年組給予等體積生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥30 d，每7 d測量小鼠質(zhì)量，根據(jù)小鼠體質(zhì)量變化調(diào)整給藥劑量。

2.2 樣本采集

各組小鼠于給藥后第30日禁食不禁水，次日眶靜脈取血，并用涂有肝素鈉的采血管盛接血液，4 ℃、3500 r/min離心15 min，取上清液（血漿），標(biāo)記后置于-80 ℃冰箱凍存。

2.3 樣本制備

取200 μL自然解凍小鼠血漿樣品，加5倍體積冰冷甲醇，渦旋3 min，將其混合液于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，上清液移至另一離心管后重復(fù)該條件再次離心，取上清液200 μL供UPLC-Q-TOF/MS分析。

2.4 分析條件

Acquity UPLCTMBEHC18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃，流動相A為乙腈（0.1%甲酸），流動相B為超純水溶液（0.1%甲酸）。

電噴霧離子源；正離子：毛細(xì)管電壓1300 V，錐孔電壓60 V，脫溶劑溫度350 ℃，錐孔氣體流速20 L/h，離子源溫度110 ℃，脫溶劑氣體流速750 L/h，碰撞能60 V；負(fù)離子：毛細(xì)管電壓1500 V，錐孔電壓70 V，脫溶劑溫度350 ℃，其他條件同正離子。準(zhǔn)確質(zhì)量測定用亮腦啡肽氨酸為校正液，濃度1 μg/L，流速20 L/min，校正頻率為15 s。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 質(zhì)譜檢測

將血漿樣品處理后進(jìn)行正負(fù)離子模式全掃描，得青年組（a）、老齡組（b）、金匱腎氣丸組（c）和六味地黃丸組（d）小鼠血漿樣品質(zhì)譜輪廓總離子流圖（見圖1），圖中各樣品代謝輪廓有明顯差異。

圖1 各組小鼠血漿樣品總離子流圖

4.2 OPLS-DA及代謝差異物篩選

對青年組和老齡組進(jìn)行OPLS-DA，結(jié)果分離效果較好（見圖2），說明隨著增齡改變，小鼠體內(nèi)整體代謝明顯變化。S-plot圖中離子越靠近“S”兩端，貢獻(xiàn)越大（見圖3），VIP圖中離子越靠近“V”兩端，對代謝輪廓軌跡產(chǎn)生變化貢獻(xiàn)越大（見圖4）。本實驗中選取VIP＞1且＜0.05認(rèn)為有顯著貢獻(xiàn)，篩選潛在生物標(biāo)志物，在人類代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫中搜庫，經(jīng)數(shù)據(jù)庫篩選及大量文獻(xiàn)查詢，對各差異物進(jìn)行生物學(xué)分析，找出其中與增齡密切相關(guān)的17個物質(zhì)，詳見表1。

注：A.正離子；B.負(fù)離子

注：A.正離子；B.負(fù)離子

注：A.正離子；B.負(fù)離子

表1 衰老相關(guān)代謝物信息

序號物質(zhì)名稱化學(xué)式VIP離子 1D-赤蘚糖-4-磷酸C4H9O7P 1.837 54正離子 2十五酰輔酶AC36H64N7O17P3S 1.571 79正離子 3二十二碳六烯酸C22H32O2 1.075 23正離子 4脫氧羥腐胺賴氨酸C10H23N3O2 2.250 67正離子 5二十二碳五烯酸C22H34O2 1.065 39正離子 6磷酸絲氨酸C3H8NO6P 1.017 39正離子 7鳥氨酸C5H12N2O2 1.207 05正離子 83-巰基乳酸C3H6O3S 5.306 19正離子 9N-間甲苯酸甘氨酸C10H11NO3 1.345 69負(fù)離子 105-胸苷酸C10H15N2O8P 1.833 99負(fù)離子 113a,12b-二羥基-5b-膽酸C24H40O4 1.281 31負(fù)離子 12?；敲撗跄懰酑26H45NO6S 1.079 30負(fù)離子 137b-羥基-3-氧代-5b-膽酸C25H38O4 1.079 30負(fù)離子 1416B-羥基四氮唑C21H32N2O2 1.746 30負(fù)離子 15神經(jīng)節(jié)苷脂GM3C53H96N2O21 2.370 34負(fù)離子 16S-(PGA2)-谷胱甘肽C30H47N3O10S 1.109 64負(fù)離子 17二十二碳六烯酸C22H32O2 2.663 04負(fù)離子

4.3 金匱腎氣丸和六味地黃丸對代謝物的調(diào)節(jié)及通路分析

PLS-DA圖顯示，金匱腎氣丸和六味地黃丸組分別與青年組、老齡組代謝輪廓明顯分離，各自聚類，說明組間差異明顯（見圖5）。金匱腎氣丸對其中15個物質(zhì)有不同程度回調(diào)（見表2），六味地黃丸對14個物質(zhì)有不同程度回調(diào)，兩者共同顯著回調(diào)且有統(tǒng)計學(xué)意義的物質(zhì)有D-赤蘚糖-4-磷酸、二十二碳六烯酸、脫氧羥腐胺賴氨酸、鳥氨酸和16B-羥基四氮唑（＜0.05）。采用Metabo Analyst4.0在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路分析，經(jīng)MetPA可視化繪圖（見圖6），5個代謝產(chǎn)物主要參與精氨酸和脯氨酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、谷胱甘肽代謝和戊糖磷酸途徑4條代謝通路。

表2 各組代謝物峰面積均值統(tǒng)計學(xué)結(jié)果（±s，n＝10）

注：與老齡組比較，*＜0.05，**＜0.01

圖6 主要代謝物MetPA分析通路圖

5 討論

腎精化腎氣，腎氣推動和調(diào)控人體的生長發(fā)育，促進(jìn)和調(diào)節(jié)全身津液代謝，是機(jī)體防御功能的根本。腎陽是腎氣中有溫煦和推動作用的部分，腎陰與腎陽協(xié)調(diào)共濟(jì)，參與臟腑氣化功能，是人體陰陽之本[4]。衰老是一種漸進(jìn)性的動態(tài)衰弱，存在陰陽虛損及失衡變化，經(jīng)典補(bǔ)腎名方金匱腎氣丸和六味地黃丸常用于延年益壽、延緩衰老。

本實驗基于UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)，經(jīng)多元統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠增齡改變，體內(nèi)代謝物質(zhì)出現(xiàn)不同程度變化，在篩選的17個與增齡密切相關(guān)的代謝物質(zhì)中，金匱腎氣丸對其中15個物質(zhì)有不同程度回調(diào)，六味地黃丸對14個物質(zhì)有不同程度回調(diào)，兩方共同顯著回調(diào)且有統(tǒng)計學(xué)意義的物質(zhì)有5個，參與的代謝通路有4條。其中戊糖磷酸途徑是一種產(chǎn)生還原型輔酶（NADPH）和合成戊糖的過程，赤蘚糖-4-磷酸是戊糖磷酸途徑中重要的中間產(chǎn)物，對細(xì)胞能量代謝、腫瘤細(xì)胞遷移有調(diào)控作用[5]。參與谷胱甘肽代謝、精氨酸和脯氨酸代謝的鳥氨酸是肝臟尿素循環(huán)中精氨酸代謝的中間體，在外周細(xì)胞中，鳥氨酸可用于合成谷氨酸和谷氨酰胺。谷氨酰胺大量存在于中樞系統(tǒng)，是多種神經(jīng)遞質(zhì)氨基酸的前體，與老年退行性疾病密切相關(guān)[6]。二十二碳六烯酸富集在不飽和脂肪酸的生物合成途徑，它是神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞生長及維持的主要成分，具有視網(wǎng)膜保護(hù)、抗炎、抗癌、抗氧化等多種功能，其抗氧化機(jī)制與清除超氧陰離子及羥基自由基，提高NADPH活力，抑制磷酸酶A2活性，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧相關(guān)[7-8]。與青年組比較，D-赤蘚糖-4-磷酸、脫氧羥腐胺賴氨酸、鳥氨酸含量在老齡組中明顯降低，而金匱腎氣丸組和六味地黃丸組表達(dá)水平均明顯上升，且趨近于青年組。

六味地黃丸中“三補(bǔ)”配伍“三瀉”，是滋補(bǔ)腎陰的代表方。金匱腎氣丸在六味地黃丸基礎(chǔ)上加辛熱之桂附，旨在化陰精以“少火生氣”，有“陰中求陽”之妙。本實驗通過初步比較研究金匱腎氣丸和六味地黃丸共同調(diào)節(jié)衰老相關(guān)代謝標(biāo)志物及代謝路徑，發(fā)現(xiàn)兩方調(diào)節(jié)作用雖有不同，但均能顯著回調(diào)5個標(biāo)志性代謝物質(zhì)，影響氨基酸、糖類和脂肪酸代謝，提示經(jīng)典補(bǔ)陰補(bǔ)陽方劑調(diào)節(jié)自然衰老的多成分多途徑作用特點。然而，衰老是一種時空性的發(fā)展進(jìn)程，針對某一階段的研究結(jié)果很難體現(xiàn)整個衰老過程及藥物干預(yù)后的機(jī)制，故本課題后期將設(shè)計不同年齡階段進(jìn)行多節(jié)點系統(tǒng)研究，結(jié)合現(xiàn)代多種系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步驗證，以期更好地探究經(jīng)典補(bǔ)益方劑延緩衰老作用機(jī)理及陰陽關(guān)系的生物學(xué)基礎(chǔ)。

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[3] WANG M, CHEN L, LIU D, et al. Metabolomics highlights pharmacological bioactivity and biochemical mechanism of traditional Chinese medicine[J]. Chemico-Biological Interactions, 2017,273：133-141.

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Effect ofPills andPills on Metabolic Substances in Plasma of Naturally Aging Mice

LIANG Hua, WANG Yan, ZHU Mingxue, GUO Hui, YAN Qi, XI Wang, LI Qiwei, LI Zeguang

To compare the effect ofPills andPills on metabolic substances in plasma of naturally aging mice; To analyze the enrichment of metabolic pathways.UPLC-Q-TOF/ MS-based metabolomics method was used to identify aging-related biomarkers through multivariate statistical analysis, combining mass spectrometry analysis with database search. Metabolic pathways were constructed through MetPA database.With aging, the metabolism of substances in mice was disordered. Among the 16 metabolites closely related to aging,Pills had different degrees of callback to 15 substances, andPills had different degrees of callback to 14 substances, and both could significantly callback D-Erythrose 4-phosphate, docosahexaenoic acid, deoxyhypusine lysine, ornithine, and 16b-hydroxystanozolol, thereby affecting pentose phosphate pathway, biosynthesis of unsaturated fatty acids, glutathione metabolism, arginine and proline metabolism pathway.BothPills andPills can adjust the metabolic disorder caused by natural aging by affecting the metabolism of amino acids, sugars and fatty acids.

Pills;Pills; metabolomics; aging; mice

R285.5

A

1005-5304(2020)06-0050-06

10.3969/j.issn.1005-5304.201909271

國家自然科學(xué)基金（81473563）

李澤光，E-mail：hljzyy_lilaoshi@yeah.net

（2019-09-18）

（2019-10-27；編輯：華強(qiáng)）