王海瑜，錢唐亮，康天倫，孫文燕，朱躍蘭，侯秀娟

腸道菌群與類風濕關節(jié)炎寒熱證型相關性研究

王海瑜1，錢唐亮1，康天倫1，孫文燕1，朱躍蘭2，侯秀娟2

1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078

通過16SrRNA高通量測序技術，研究膠原誘導性關節(jié)炎（CIA）寒證與熱證大鼠腸道菌群差異。雌性Wistar大鼠30只，按隨機數(shù)字表法分為正常組8只、寒證組和熱證組各11只。正常組常規(guī)飼養(yǎng)，寒證組和熱證組復制CIA寒熱證候動物模型。從造模第2周起，每周測量1次大鼠右后足踝體表溫度，造模結束后腹主動脈取血檢測凝血因子，取腸道內容物，進行總DNA提取，V3-V4可變區(qū)PCR擴增，產(chǎn)物純化后進行測序，測序的有效數(shù)據(jù)進行可操作分類單元（OTUs）聚類，根據(jù)OTUs進行物種注釋、Alpha與Beta多樣性分析，得到樣品的物種信息。造模第2周時，寒證組、熱證組大鼠右足溫度較正常組均不同程度升高，3～4周時，與正常組和寒證組比較，熱證組大鼠右足溫逐漸升高，寒證組大鼠右足溫度逐漸降低，第4周時，顯著低于正常組和熱證組；寒證組纖維蛋白原高于正常組和熱證組；測序后得1 213 914條有效序列，聚類后正常組、寒證組及熱證組分別獲得206、335、304個特征OTUs；正常組、寒證組及熱證組間菌群結構差異均有統(tǒng)計學意義（＜0.01），正常組優(yōu)勢菌種有擬桿菌門、蘇黎世桿菌目、蘇黎世桿菌科、梭菌科、莫氏桿菌科、伯克氏菌科，寒證組優(yōu)勢菌種有柔膜菌門、α-變形菌門、巴斯德菌科、根瘤菌目、巴斯德菌目、皮桿菌科、腸球菌科，熱證組優(yōu)勢菌種有變形菌門。寒證和熱證CIA模型大鼠腸道菌群失調，且寒證與熱證之間菌群結構存在差異。

腸道菌群；類風濕關節(jié)炎；寒證；熱證；16SrRNA測序；大鼠

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性、慢性、自身免疫性疾病，典型臨床表現(xiàn)為對稱性的關節(jié)腫脹、疼痛、晨僵及畸形，基本病理改變?yōu)榛ぱ?。根?jù)不同癥候群可分為不同證型，其中寒證與熱證具有代表性和特征性。人體腸道微生物菌群數(shù)量是人體基因數(shù)量的100倍，所以被稱為人體“第二基因庫”，這些基因賦予了細菌不同的功能，參與機體免疫調節(jié)過程。研究表明，菌群失調可導致RA的發(fā)生發(fā)展[1-2]。生物信息技術發(fā)展促進了腸道菌群的研究，16SrRNA測序技術是最常用的高通量測序依賴的組學技術之一，該技術著眼于對腸道微生物群落菌種組成的分析，可對復雜樣品中混合菌種的分類學進行鑒定并精確定量?；诖耍緦嶒灲柚?6SrRNA高通量測序技術獲得膠原誘導性關節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）寒熱證候大鼠腸道微生物信息，再經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對分析得到功能注釋，以期系統(tǒng)探討CIA寒熱證候大鼠腸道的微生物組成，為臨床和科研提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

普通級雌性Wistar大鼠30只，體質量（110±10）g，鼠齡6～8周，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于溫度（24±2）℃、相對濕度60%～70%普通動物房。適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為正常組、寒證組、熱證組。

1.2 主要試劑與儀器

牛Ⅱ型膠原（20022，美國Chondrex公司），不完全弗氏佐劑（7002，美國Sigma公司），戊巴比妥鈉（北京化學試劑公司），E.Z.N.A.?soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.），Illumina MiSeq平臺（San Diego，USA），AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）。QuantiFluor?-ST微型熒光計（Promega，USA），PCR儀（ABI GeneAmp?9700型），高速分散器（S10寧波新芝生物科技股份有限公司），全自動血凝儀（CA-1500日本Sysmex公司），紅外線溫度檢測儀（DT-8550深圳市凱恒捷科技有限公司），電子天平（YP2001N上海精研電子科技有限公司），動物氣候箱（SHH-500ZSD重慶永生實驗儀器廠）。

1.3 造模

將溶于乙酸的牛Ⅱ型膠原蛋白（濃度2 mg/mL），與等量不完全弗氏佐劑充分混合成1 mg/mL的混合物，并用高速分散器攪拌成“油包水”狀，隨后于每只大鼠左足皮下注射0.1 mL，尾根部分三點真皮內注射0.1 mL，同時壓迫注射部位使乳化物完全吸收。7 d后再次于大鼠尾根部真皮內分三點注射0.1 mL，加強免疫1次[3]。正常組大鼠左足皮下注射0.1 mL生理鹽水。CIA寒證及熱證模型參考本課題組前期工作基礎及文獻并進行改良[3-4]。在CIA造模基礎上，應用動物氣候箱，寒證組設定風速6 mL/s、相對濕度95%、溫度6 ℃，熱證組設定風速6 mL/s、相對濕度95%、溫度33 ℃。從初次免疫后給予風寒濕、風濕熱刺激，造模時間持續(xù)28 d。正常組不做任何處理，寒證組在造模期間死亡1只大鼠。

1.4 行為學及表征評估

造模期間每周觀察大鼠一般狀況，每周評估1次關節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）。AI評分標準：0分，無關節(jié)紅腫；1分，小趾關節(jié)腫脹；2分，趾關節(jié)及足跖關節(jié)腫脹；3分，踝關節(jié)以下足爪腫脹；4分，包括踝關節(jié)在內的全部足爪腫脹。最高分為16分，AI≥4分定義為模型成功。

1.5 關節(jié)體表溫度測定

從造模第2周開始，每周1次，使用紅外線溫度檢測儀測量大鼠右后足踝部關節(jié)處體表溫度，取2次平均值。

1.6 樣本采集

造模結束后，將大鼠麻醉、處死，腹主動脈取血，以檸檬酸鈉抗凝管采全血5 mL，待測凝血指標。取結腸與直腸的內容物，置于無菌凍存管中，放入液氮速凍，-80 ℃超低溫冰箱保存，用于腸道菌群信息分析。

1.7 DNA抽提和PCR擴增

根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量；用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增。

1.8 Illumina Miseq測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行純化，Tris-HCl洗脫，電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST微型熒光計進行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建PE 2*300的文庫，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序。

1.9 統(tǒng)計學方法

1.10 生物信息學分析

對測序得到的原始序列進行過濾處理，得到特征序列。使用QIIME2的DADA2方法去噪去嵌合，然后基于有效數(shù)據(jù)進行可操作分類單元（OTUs）聚類，用Shaanon指數(shù)分析物種飽和度，組間群落差異分析（LDA effect size，LEfSe）采用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）法鑒定組間豐度有差異的細菌，用Shaanon指數(shù)、Chao1指數(shù)、observed species指數(shù)分析物種Alpha多樣性，用主坐標分析（PCoA）圖結合多元方差（Permanova）分析組間Beta多樣性。

2 結果

2.1 一般狀況

正常組大鼠活動靈敏，體質量逐漸增加，皮毛光澤，攝食量正常；寒證組大鼠7 d后逐漸出現(xiàn)大便稀，聚團喜暖，飲水量減少，舌質紫黯；熱證組大鼠則飲水量偏多，小便黃，煩躁不安，舌質偏紅。

2.2 各組右足體表溫度比較

造模第2周，寒證組、熱證組大鼠右足溫度較正常組均不同程度升高（＜0.01）；第3～4周時，與正常組和寒證組比較，熱證組大鼠右足溫明顯升高（＜0.01）；寒證組大鼠右足溫度逐漸降低，第4周時顯著低于正常組和熱證組（＜0.01）。見表1。

表1 造模后各組大鼠右足體表溫度比較（±s，℃）

注：與正常組比較，**＜0.01；與寒證組比較，△△＜0.01

2.3 各組凝血指標比較

寒證組纖維蛋白原濃度顯著高于正常組和熱證組（＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠凝血指標比較（±s）

注：與正常組比較，**＜0.01；與寒證組比較，△△＜0.01

2.4 測序質量評估及物種注釋分析結果

測序數(shù)據(jù)經(jīng)barcode拆分后，總共獲得1 213 914條有效序列，有效序列范圍為31 986～53 445條，平均為41 859條。由Shaanon指數(shù)和observed species指數(shù)可看出，各組大鼠腸道菌群多樣性指數(shù)均大于2，實際OTUs數(shù)目均大于200，且稀釋曲線趨于平緩，表明測序結果可反映當前樣本所包含的多樣性，繼續(xù)增加測序深度已無法檢測到大量的尚未發(fā)現(xiàn)的新OTUs。見圖1、圖2。

圖1 各組樣本shannon稀釋性曲線圖

圖2 各組樣本observed species稀釋性曲線圖

通過3組樣本聚類得到的OTUs差異韋恩圖可以看出，3組共有343個相同OTUs，正常組有206個特征OTUs，寒證組有335個特征OTUs，熱證組304個特征OTUs。見圖3。

圖3 各組樣本聚類差異韋恩圖

2.5 大鼠腸道菌群組成結構分析結果

統(tǒng)計各組門水平與科水平豐度排名前20的物種，并繪制柱狀圖。門水平各組優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形桿菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、藍澡菌門（Cyanobacteria）、螺旋體菌門（TM7）、未明確細菌（Unspecified_Bacteria）、未經(jīng)分類細菌（unclassified）等。其中厚壁菌門所占比例最大（73.64%），見圖4。科水平菌落結構依次為未具體分類_梭菌（Unspecified_Clostridiales）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、未具體分類_擬桿菌目（Unspecified_Bacteroidales）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）等，見圖5。

2.6 組間差異物種篩選

用LEfSe法尋找每個分組特征微生物（LDA＞2為差異有統(tǒng)計學意義）。柱狀圖長度代表每組物種對差異效果影響的大小。門水平正常組優(yōu)勢菌種為擬桿菌門（firmicutes），寒證組優(yōu)勢菌種為柔膜菌門（Tenericutes），見圖6?？扑秸＝M優(yōu)勢菌種有蘇黎世桿菌目（Turicibacterales）、蘇黎世桿菌科（Turicibacteraceae）、梭菌科（Clostridiaceae）、莫氏桿菌科（Mogibacteriaceae）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae），寒證組優(yōu)勢菌種為α-變形菌門（Alphaproteobacteria）、巴斯德菌科（Pasteurellaceae）、根瘤菌目（Rhizobiales）、巴斯德菌目（Pasteurellales）、皮桿菌科（Dermabacteraceae）、腸球菌科（Enterococcaceae）。熱證組優(yōu)勢菌種為變形菌門（Proteobacteria），見圖7。

圖4 基于門水平各組大鼠腸道微生物群落結構

圖5 基于科水平各組大鼠腸道微生物群落結構

圖6 LEfSe分析門水平LDA柱形圖

圖7 LEfSe分析科水平LDA柱形圖

2.7 各組大鼠腸道菌群多樣性分析

Alpha多樣性主要用來分析單個樣品菌群的種類數(shù)量（即豐富度）與分配上的均勻度（即多樣性）。其中Chao1、observed species指數(shù)代表菌群的豐富度（species richness），其值越高表示該樣本菌群豐富度越高，Shannon指數(shù)代表菌群的多樣性，數(shù)值越高表示菌群多樣性越高。結果顯示，各組大鼠腸道菌群多樣性與豐富度未見明顯差異（＞0.05），見表3。進一步分析3組間群落Beta多樣性指數(shù)，PCoA結合Permanova顯示，寒證組與熱證組、寒證組與正常組、熱證組與正常組之間差異均有統(tǒng)計學意義（＜0.01），見圖8。

表3 各組大鼠腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)比較（±s）

圖8 各組大鼠腸道菌群PCoA分析圖

3 討論

RA證候分型尚無統(tǒng)一標準。寒熱作為八綱辨證中的兩綱，是對陰陽兩綱的直接反映，貫穿RA的整個疾病過程[5]。因此，從腸道微生態(tài)角度探討RA寒證與熱證的生物學內涵具有重要的臨床意義。

造模第2周時，寒證組、熱證組右足溫度較正常組均不同程度升高；3～4周時，與正常組和寒證組比較，熱證組大鼠右足溫逐漸升高；寒證組大鼠右足溫度逐漸降低，4周時顯著低于正常組和熱證組。說明寒證組在造模初期接受風寒濕刺激時間較短，關節(jié)紅腫熱痛，膚溫升高，在風寒濕外界因素的持續(xù)刺激下，出現(xiàn)由熱轉寒的證候變化，寒證模型趨于穩(wěn)定。熱證組在風濕熱的刺激下，關節(jié)紅腫熱痛日益加重，足踝溫度亦逐漸升高。凝血指標方面，纖維蛋白原參與血栓的形成，可促進血液凝固，寒證組纖維蛋白原升高提示風寒濕持續(xù)刺激下導致“寒凝血瘀”，血液黏度增加。結合造模期間寒證組出現(xiàn)大便稀，聚團喜暖、飲水量減少、舌質紫黯，熱證組大鼠則飲水量量偏多、小便黃、煩躁不安，舌質偏紅，表明本實驗所復制寒、熱兩組大鼠模型能滿足RA病證結合動物模型的要求。

本研究通過16SrRNA測序技術分析CIA寒證、熱證及正常組大鼠的菌群構成，結果顯示3組Alpha多樣性組內菌群數(shù)量與豐度無顯著差異。但通過PCoA結合Permanova分析3組間Beta多樣性時，發(fā)現(xiàn)正常組、寒證組、熱證組之間菌群存在明顯差異。說明CIA寒、熱證大鼠與正常大鼠之間群落結構明顯不同，CIA寒、熱證之間微生物群落亦存在差異。

基于門水平、科水平進一步通過LEfSe法尋找組間差異菌種，結果表明，正常組大鼠腸道菌群優(yōu)勢菌種為擬桿菌門、蘇黎世桿菌目、蘇黎世桿菌科、梭菌科、莫氏桿菌科、伯克氏菌科，其中有益菌及中性菌擬桿菌門、蘇黎世桿菌目、蘇黎世桿菌科、梭菌科豐度占明顯優(yōu)勢。與正常組比較，熱證組優(yōu)勢菌種有變形菌門，寒證組優(yōu)勢菌種有柔膜菌門、α-變形菌門、根瘤菌目、巴斯德菌目、巴斯德菌科、皮桿菌科、腸球菌科。其中α-變形菌門、根瘤菌目、巴斯德菌目、巴斯德菌科均可歸類為變形菌門，由此可知變形菌門可能參與RA的慢性炎性過程。變形菌門中包含很多致病菌與條件致病菌，變形菌門的增加與很多疾病密切相關[6]。此外，寒證組優(yōu)勢菌種為柔膜菌門、腸球菌科及皮桿菌科。Peng等[7]研究發(fā)現(xiàn)，柔膜菌門參與了RA的病理過程，但與正常組比較，CIA大鼠柔膜菌門豐度減低，與本研究顯示寒證組柔膜菌門豐度增加存在差異，可能與風寒濕持續(xù)刺激改變腸道菌群結構有關。腸球菌屬厚壁菌門，廣泛分布于人和動物消化道，腸球菌具有雙重作用，正常情況對人體有益，一旦增殖失控，就會引發(fā)多種疾病，或影響免疫系統(tǒng)。譚迪[8]將從RA患者腸道中分離出的特征性細菌給予CIA大鼠灌胃，3個月后發(fā)現(xiàn)屎腸球菌灌胃大鼠關節(jié)發(fā)生變形，甚至出現(xiàn)行走障礙，由此認為屎腸球菌可進一步誘導RA發(fā)生。皮桿菌科與RA的關系迄今未見報道。皮桿菌科屬放線菌門，RA患者腸道菌群多樣性降低，但放線菌門卻增加，有學者發(fā)現(xiàn)放線菌門中Collinsella、Eggerthella及Faecalibacterium可作為區(qū)分RA患者與對照組的腸道菌群，同時Collinsella可改變腸道通透性和IL-17A的產(chǎn)生，與疾病的嚴重程度密切相關[9]。因此，皮桿菌科作為放線菌門的菌種之一，可能在RA發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。大量臨床研究表明，普氏菌可能為RA的優(yōu)勢菌種[10-12]。但本研究未發(fā)現(xiàn)普氏菌參與CIA寒熱證候大鼠的慢性病理過程，可能因腸道菌群的改變在不同種屬間存在差異有關。

綜上，CIA寒證組、熱證組大鼠較正常組腸道菌群存在明顯失調現(xiàn)象，且寒證組與熱證組之間菌群結構亦存在差異，寒證組變形菌門的菌種更加豐富，且較熱證組增加柔膜菌門、皮桿菌科和腸球菌科。將RA中醫(yī)證候與腸道菌群貫通起來研究，有助于深化對中醫(yī)證候內涵的理解。但腸道菌群如何影響免疫系統(tǒng)，進而引起局部或全身免疫反應，還需進一步研究證實。此外，中醫(yī)藥治療RA有其獨特優(yōu)勢，藥物有效成分進入腸道后對失調菌群的調節(jié)可能是其發(fā)揮作用的重要環(huán)節(jié)，基于腸道菌群探討中醫(yī)藥防治RA作用機制將是我們下一步的研究重點。

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Study on Correlation Between Intestinal Flora and Rheumatoid Arthritis with Cold-heat Syndromes

WANG Haiyu1, QIAN Tangliang1, KANG Tianlun1, SUN Wenyan1, ZHU Yuelan2, HOU Xiujuan2

To study the difference of intestinal flora between collagen-induced arthritis (CIA) cold-heat syndromes rats by 16SrRNA high-throughput sequencing technology.Totally30 female Wistar rats were divided into normal group (=8), cold syndrome group (=11) and heat syndrome group (=11) according to random number table method. The normal group was routinely raised. The cold and heat syndrome groups were duplicated with CIA cold and heat syndrome. From the second week of modeling, the body surface temperature of the right ankle of rats was measured once a week. After the end of modeling, the abdominal aorta was taken to detect the coagulation factor. The intestinal contents were taken; the total DNA was extracted; the V3-V4 variable region was amplified by PCR; the products were purified and tested; the sequenced valid data were classified into operational taxonomic units (OTUs); species annotation, Alpha and Beta diversity analysis were performed according to OTUs to obtain the species information of the samples.At the second week of modeling, the temperature of right ankle in cold syndrome group and heat syndrome group was higher than that in normal group. At 3–4weeks, compared with normal group and cold syndrome group, the temperature of right ankle in heat syndrome group increased gradually. The temperature of right ankle in cold syndrome group decreased gradually, and at the 4th week, it was significantly lower than that in normal group and heat syndrome group. Fib in cold syndrome group was higher than that in normal group and heat syndrome group. After sequencing, a total of 1 213 914 effective sequences were obtained. After clustering, 206 characteristic OTUs were obtained in the normal group, 335 were obtained in the cold syndrome group, and 304 were obtained in the heat syndrome group. There was statistical significance in flora structure among normal group, cold syndrome group and heat syndrome group (<0.01). The dominant strains in the normal group were firmicutes, Turicibacterales, Turicibacteraceae, Clostridiaceae, Mogibacteriaceae, and Burkholderiaceae; The dominant strains of cold syndrome group included Tenericutes, Alphaproteobacteria, Pasteurellaceae, Rhizobiales, Pasteurellales, Dermabacteraceae, and Enterococcaceae; The dominant strains in heat syndrome was Proteobacteria.The intestinal flora of the CIA cold syndrome and the heat syndrome is dysregulated, and there are differences in bacterial structure between the cold and heat syndrome.

intestinal flora; rheumatoid arthritis; cold syndrome; heat syndrome; 16SrRNA sequencing; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)06-0044-06

10.3969/j.issn.1005-5304.201910175

國家自然科學基金（81774275）；北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院1166人才培養(yǎng)計劃（040204001001002006）

侯秀娟，E-mail：houxiujuan2008@163.com

（2019-10-14）

（2019-11-19；編輯：華強）