李海燕，楊勇，高晨，任長虹

論著·實(shí)驗(yàn)研究

當(dāng)歸芍藥散對(duì)缺血性腦卒中小鼠腦保護(hù)作用的影響

李海燕1，楊勇2，高晨1，任長虹1

1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院低氧醫(yī)學(xué)研究所，北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029

觀察當(dāng)歸芍藥散對(duì)缺血性腦卒中小鼠腦保護(hù)作用的影響，探討其可能的作用機(jī)制。取成年C57雄性小鼠，制備大腦中動(dòng)脈梗阻（MCAO）模型。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（MCAO組）和當(dāng)歸芍藥散組（DSS組），進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分和腦組織TTC染色，觀察小鼠神經(jīng)功能和腦梗死體積，免疫熒光染色和電化學(xué)發(fā)光法檢測小鼠腦組織相關(guān)指標(biāo)水平。與MCAO組比較，DSS組小鼠腦梗死體積明顯減小（＜0.001），細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少（＜0.05），神經(jīng)功能有一定程度的恢復(fù)（＜0.01），小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少（＜0.01），同時(shí)，當(dāng)歸芍藥散可促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞極化（＜0.01），降低促炎因子、增加抑炎因子的表達(dá)（＜0.01，＜0.001）。當(dāng)歸芍藥散對(duì)缺血性腦卒中小鼠具有腦保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化有關(guān)。

當(dāng)歸芍藥散；缺血性腦卒中；小膠質(zhì)細(xì)胞極化；炎性反應(yīng)；小鼠

腦中風(fēng)以其高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高死亡率及逐年遞增的防治費(fèi)用成為危害人民健康最為嚴(yán)重的疾病之一，其人群疊加效應(yīng)和快速增長給社會(huì)、家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力，已成為嚴(yán)重影響國計(jì)民生的重要公共衛(wèi)生問題[1-2]。因此，研究有效治療藥物對(duì)社會(huì)意義重大。當(dāng)歸芍藥散對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用已得到共識(shí)[3]，然而其確切機(jī)制尚不十分明確。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫細(xì)胞，參與缺血性腦損傷的炎癥反應(yīng)和損傷修復(fù)[4]。在缺血性腦損傷中，小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為M1和M2兩種不同的極化表型[5-6]。本研究制備小鼠大腦中動(dòng)脈梗阻（MCAO）模型，觀察當(dāng)歸芍藥散對(duì)缺血/再灌注腦損傷模型小鼠保護(hù)作用的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)C57/BL6雄性小鼠88只，體質(zhì)量20～24 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2007-0001。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（45±5）%，日照時(shí)間12 h。小鼠分籠喂養(yǎng)，每5只1籠，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

當(dāng)歸芍藥散（當(dāng)歸、川芎、白芍、澤瀉、茯苓、白術(shù)比例為3∶3∶16∶8∶4∶4），飲片購自北京同仁堂，采用醇提水沉法提取各個(gè)樣品，按1∶5（W/V）比例加入95%乙醇，室溫過夜，然后煮沸2次×2 h。過濾，離心，留取提取液，剩余藥物殘?jiān)尤胝麴s水（1∶4，W/V）煮沸2次×1 h。過濾，離心，留取提取液，將2次提取液混合測濃度，調(diào)至為1 g/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

恩氟烷（河北一品制藥制藥股份有限公司，批號(hào)C001180702），2,3,5-氯化三苯基四氮唑藍(lán)（TTC）（Sigma，貨號(hào)17779），抗cleaved Caspase3多克隆抗體（Abcam，貨號(hào)ab2302），抗CD68多克隆抗體（Santa Cruze，貨號(hào)sc-20060），抗CD16/32多克隆抗體（Abcam，貨號(hào)ab25235），抗CD206多克隆抗體（Abcam，貨號(hào)ab64693），抗Iba1抗體（Wako，貨號(hào)019-19741），免疫熒光二抗（Lifetechnologies，貨號(hào)A-21203，A-32723）。小動(dòng)物肛溫檢測儀（Harvard Apparatus），電子分析天平（瑞士Mettler公司，型號(hào)AE160），高頻小電刀（上海醫(yī)療器械技術(shù)公司，型號(hào)1411），ROTO-ROD儀（IITC Life Science，型號(hào)092517-755），激光共聚焦顯微鏡（Leika，型號(hào)TCS SP8）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

小鼠稱重后予5%恩氟烷誘導(dǎo)麻醉，1%～2%恩氟烷混合70%N2O和30%O2維持麻醉，采用Zea Longa線栓法[7]制備小鼠右側(cè)MCAO模型，小鼠腹下墊恒溫墊，術(shù)中肛溫維持在（37±2）℃。術(shù)中小心分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，將線拴由頸外動(dòng)脈殘端插入頸內(nèi)動(dòng)脈，至距頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈分叉處約1.8 cm，栓塞60 min后拔除栓子，制備缺血/再灌注損傷模型。手提小鼠尾部，可見左側(cè)前肢屈曲，視為模型成功。假手術(shù)組（Sham組）僅分離上述各血管，不插入線拴。

2.2 分組及給藥

實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為Sham組、MCAO組和當(dāng)歸芍藥散組（DSS組），每組8只。根據(jù)前期研究工作[8]，換算小鼠每日當(dāng)歸芍藥散給藥量為866 mg/kg。DSS組給予當(dāng)歸芍藥散藥液灌胃，MCAO組給予等量生理鹽水灌胃。各組均在缺血30 min后第1次給藥，給藥體積10 mL/kg，每日1次，給藥1 d或3 d。

2.3 腦梗死體積測定

術(shù)后3 d（每組7只）處死小鼠，在視交叉處向后切厚度為1 mm冠狀切片4片，視交叉前切2片。將腦片置于用PBS（pH 7.4）配制1%TTC染液，37 ℃染色5 min。正常腦組織染成深紅色，缺血腦組織染成蒼白色。相機(jī)拍攝，使用ImagePro Plus圖像分析軟件計(jì)算腦梗死面積[9]。梗死面積百分率（%）＝梗死區(qū)腦組織體積÷正常側(cè)大腦半球體積×100%。

2.4 神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度評(píng)分

術(shù)前1 d及術(shù)后1、3、5、7 d（每組8只）進(jìn)行神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度評(píng)分，包括運(yùn)動(dòng)功能和感覺功能檢測[10]。運(yùn)動(dòng)功能檢測：提起小鼠尾部（正常0分，前肢屈曲1分，后肢屈曲1分，頭部在30 s內(nèi)沿垂直軸移動(dòng)＞10°1分，最大值3分）；將小鼠放置地面（正常0分，無法直走1分，向輕癱側(cè)打轉(zhuǎn)2分，向輕癱測傾倒3分）。感覺功能檢測：觸覺反應(yīng)通過用牙簽碰觸前爪掌區(qū)來實(shí)現(xiàn)（正常0分，減緩反應(yīng)1分，無反應(yīng)2分）；本體感覺反應(yīng)通過用棉棒放在雙側(cè)脖頸處實(shí)現(xiàn)（正常0分，減緩反應(yīng)1分，沒有反應(yīng)2分）。將所有評(píng)分相加作為神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度最后分值。

2.5 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)

術(shù)前1 d及術(shù)后3、5、7 d（每組8只）進(jìn)行轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)。將小鼠放在加速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)棒上（5 min內(nèi)從4 r/min加速到40 r/min），直到小鼠掉落，記錄停留時(shí)間，5 min內(nèi)仍未掉下按5 min計(jì)算。每只小鼠每日進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)間隔20 min。

2.6 免疫熒光染色方法檢測cleaved Caspase-3、CD68、Iba1、CD16/32和CD206的表達(dá)

術(shù)后1 d（每組6只）取材，檢測cleaved Caspase-3的表達(dá)；術(shù)后3 d（每組6只）取材，檢測CD68、Iba1、CD16/32和CD206的表達(dá)。小鼠麻醉后使用生理鹽水由心臟灌注，取腦組織后固定于4%多聚甲醛（4%PFA），置于4 ℃冰箱，經(jīng)30%蔗糖脫水，至腦組織自然沉淀，冰凍切片10 μm。用1%BSA-PBST，室溫封閉60 min。甩去封閉液，滴加一抗，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。PBS清洗3次，每次10 min。二抗用Alex488或Alex594標(biāo)記。不加一抗作為陰性對(duì)照，以確認(rèn)抗體免疫反應(yīng)特異性。室溫避光孵育1 h，PBS清洗3次，每次10 min。用含有DAPI的封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察，使用Image Pro Plus V軟件進(jìn)行分析。

2.7 電化學(xué)發(fā)光法檢測促炎因子和抑炎因子的表達(dá)

小鼠術(shù)后3 d（每組6只）取梗死側(cè)腦組織，用RIPA buffer按照1∶9（W/V）比例裂解蛋白。用BCA法檢測蛋白濃度。配制1×PBS（0.05%吐溫-20）清洗液，配制2×讀板液，每孔加150 μL Blocker H溶液，并用封口膜封上，室溫孵育1 h，清洗電化學(xué)發(fā)光板3次，每次150 μL清洗液，每孔加入50 μL樣本、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，并用封口膜封上，室溫振蕩2 h，清洗電化學(xué)發(fā)光板3次，每次150 μL清洗液，每孔加入配制好的25 μL檢測抗體，并用封口膜封上，室溫振蕩2 h，清洗電化學(xué)發(fā)光板3次，每次150 μL清洗液，每孔加入150 μL配制好的讀板液，上機(jī)檢測。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 當(dāng)歸芍藥散對(duì)模型小鼠腦梗死體積及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

與MCAO組比較，DSS組小鼠腦梗死體積明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.001），結(jié)果見圖1。

4.2 當(dāng)歸芍藥散對(duì)模型小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

術(shù)后1 d檢測梗死周邊區(qū)細(xì)胞凋亡的數(shù)量，用抗cleaved Caspase-3抗體標(biāo)記凋亡細(xì)胞，結(jié)果顯示，與MCAO組比較，DSS組小鼠細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），結(jié)果見圖2、圖3。

注：a. Sham組；b. MCAO組；c. DSS組；d.高倍圖（DSS組）

注：與MCAO組比較，*P＜0.05

4.3 當(dāng)歸芍藥散對(duì)小鼠神經(jīng)功能評(píng)分和轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間的影響

與MCAO組比較，DSS組小鼠腦組織神經(jīng)功能有所改善，各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分較MCAO組低，轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間更長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。結(jié)果見圖4。

注：與MCAO組比較，**P＜0.01

4.4 當(dāng)歸芍藥散對(duì)模型小鼠腦組織梗死周邊區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞數(shù)量的影響

采用CD68抗體標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示，與MCAO組比較，DSS組降低腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 各組小鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞形態(tài)（免疫熒光染色，標(biāo)尺＝50 μm）

注：與MCAO組比較，**P＜0.01

4.5 當(dāng)歸芍藥散對(duì)模型小鼠腦組織M1和M2型巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響

免疫熒光雙標(biāo)方法檢測M1型（CD16/32）及M2型（CD206）小膠質(zhì)細(xì)胞，與MCAO組比較，DSS組小鼠腦組織M1陽性標(biāo)志物CD16/32+/Iba1+表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），見圖7、圖8。同時(shí)，DSS組小鼠腦組織M2型巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量（標(biāo)志物為CD206+/Iba1+細(xì)胞）顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），見圖9～圖10。

4.6 當(dāng)歸芍藥散對(duì)模型小鼠腦組織促炎因子和抑炎因子水平的影響

與MCAO組比較，DSS組小鼠腦組織促炎因子腫瘤壞死因子（TNF）-α和白細(xì)胞介素（IL）-6水平降低，抑炎因子IL-10水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），結(jié)果見圖11。

圖7 各組小鼠腦組織M1型小膠質(zhì)細(xì)胞陽性表達(dá)（免疫熒光染色，標(biāo)尺＝50 μm）

注：與Sham組比較，#P＜0.05；與MCAO組比較，**P＜0.01

圖9 各組小鼠腦組織M2型小膠質(zhì)細(xì)胞陽性表達(dá)（免疫熒光染色，標(biāo)尺＝50 μm）

注：與Sham組比較，#P＜0.05；與MCAO組比較，**P＜0.01

注：與Sham組比較，#P＜0.05；與MCAO組比較，**P＜0.01，***P＜0.001

5 討論

當(dāng)歸芍藥散出自《金匱要略》，主治“婦人懷妊，腹中疞痛”及“婦人腹中諸疾痛”。近年來，該方被用于腦血管疾病，如血管性癡呆、腦梗死等[11-13]。有研究報(bào)道，當(dāng)歸芍藥散治療腦梗死機(jī)制可能是通過干預(yù)基質(zhì)金屬蛋白酶-9發(fā)揮腦保護(hù)作用[14]。

小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中的巨噬細(xì)胞，在發(fā)育、維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)和在疾病的病理生理中具有重要的作用[15-16]。在生理?xiàng)l件下，小膠質(zhì)細(xì)胞主要處于靜息狀態(tài)（M0），組織遭受缺血缺氧等損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，出現(xiàn)2種主要表型，即“經(jīng)典激活”（M1型）和“選擇性激活”（M2型）。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌多種促炎因子，如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α[17-18]，而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生具有抑炎作用的細(xì)胞因子IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β等。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸芍藥散治療后，模型小鼠神經(jīng)功能得到改善，神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量減少。同時(shí)，與MCAO組比較，DSS組小膠質(zhì)細(xì)胞總量減少，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，促炎因子TNF-α、IL-6水平降低，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，抑炎因子IL-10水平升高。由此我們推斷，當(dāng)歸芍藥散對(duì)缺血性腦損傷具有比較明確的保護(hù)作用，可能與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的極化有關(guān)。腦為奇恒之府，是髓之海，由腎精充養(yǎng)，是神明所居，亦為心神之機(jī)關(guān)，腦髓由經(jīng)絡(luò)和血絡(luò)貫連，腦絡(luò)是腦神的功能和結(jié)構(gòu)載體，具有貫通營衛(wèi)、環(huán)流經(jīng)氣、滲透氣血、互化津血的生理功能，是內(nèi)外溝通的橋梁，腦髓之絡(luò)脈暢達(dá)，氣血充盈是其發(fā)揮功用的結(jié)構(gòu)和物質(zhì)基礎(chǔ)。脾主化生氣血，升發(fā)清陽，是腦髓發(fā)揮正常功能的物質(zhì)源泉，肝主疏泄調(diào)達(dá)，能保障腦髓絡(luò)脈的疏通暢達(dá)，如果脾失健運(yùn)，水濕內(nèi)停，上犯腦絡(luò)，肝失疏泄，血瘀絡(luò)阻，均可影響腦絡(luò)，而致腦絡(luò)受損，神機(jī)失養(yǎng)，造成神機(jī)運(yùn)動(dòng)物質(zhì)基礎(chǔ)匱乏，臟腑形骸信息聯(lián)絡(luò)欠暢，如果損傷日久，濕聚成痰，瘀久生熱，甚至化火動(dòng)風(fēng)，則中風(fēng)病的發(fā)生在所難免。當(dāng)歸芍藥散以當(dāng)歸、白芍、川芎調(diào)肝理血，白術(shù)、茯苓、澤瀉健脾調(diào)津，全方三血三水之品相濟(jì)并用，共奏調(diào)肝健脾、活血利水之功。有研究報(bào)道，當(dāng)歸芍藥散能改善中風(fēng)后患者生存質(zhì)量，提高獨(dú)立生活能力[3]。我們以往的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸芍藥散能促進(jìn)缺血性中風(fēng)亞急性期神經(jīng)功能恢復(fù)，促進(jìn)血管新生、神經(jīng)再生[8]。

綜上，臨床實(shí)踐的拓展和基礎(chǔ)研究的深入以及中醫(yī)腦病理論的創(chuàng)新讓我們對(duì)古方新用研究有了長足發(fā)展，當(dāng)歸芍藥散在神經(jīng)保護(hù)作用方面的應(yīng)用有待深入研究。

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Protective Effects ofPowder on the Brain of Mice with Cerebral Ischemic Stroke

LI Haiyan1, YANG Yong2, GAO Chen1, REN Changhong1

To observe the protective effects ofPowder (DSS) on the brain of mice with cerebral ischemic stroke; To explore its possible mechanism.Adult C57 male mice were used to create the middle cerebral artery obstruction (MCAO) model. Mice which were randomly divided into sham-operation group, MCAO group and DSS group. The mice were scored for neurological function and TTC staining of brain tissue, and the neurological function and cerebral infarction volume were observed. Immunofluorescence staining and electrochemical luminescence were used to detect the levels of brain tissue related indicators.Compared with the MCAO group, the cerebral infarction volume of DSS group was reduced (<0.001), the number of apoptosis decreased (<0.05), the neurological function was restored (<0.01), and the number of microglia/macrophages decreased (<0.01). Meanwhile, DSS promoted the polarization of M2-type macrophages/microglias (<0.01), decreased the expression of pro-inflammatory factors and increased the expression of anti-inflammatory factors (<0.01,<0.001).DSS has brain protective effects on brain of male mice with ischemic stroke, and the mechanism may be related to inhibiting cell apoptosis and regulating microglial polarization.

Powder; cerebral ischemic stroke; microglia polarization; inflammatory reaction; mice

R285.5

A

1005-5304(2020)06-0038-06

10.3969/j.issn.1005-5304.201911279

國家自然科學(xué)基金（81573867、81473591）

任長虹，E-mail：rench@xwhosp.org

（2019-11-14）

（2019-12-18；編輯：華強(qiáng)）