羅吉輝 楊熙華 肖方濤 周美華

(湖南省郴州市第一人民醫(yī)院南院腫瘤外科二區(qū)，郴州市 423000，電子郵箱:Luojihui123@163.com)

在全球范圍內(nèi)每年有超過50萬的新診斷肝癌患者[1-2]，而我國的肝癌發(fā)病率居高不下[3]，該病具有生長非常迅速、侵襲轉(zhuǎn)移能力強、惡性度高和治療效果差及預(yù)后不佳等特點[4]。患者早期無任何癥狀和體征，一旦身體出現(xiàn)不適癥狀，有可能已經(jīng)失去了最佳手術(shù)機會[5]。鑒于以上原因，尋找治療肝癌的有效藥物迫在眉睫。茅蒼術(shù)也被稱為南蒼術(shù)，主要分布于江蘇茅山等地區(qū)[6-7]?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，茅蒼術(shù)具有抗痛風，治療夜盲癥、原發(fā)性高脂血、膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病和外陰瘙癢等作用[8-9]。近年來，多項研究顯示茅蒼術(shù)對動物移植性腫瘤S180、小鼠淋巴肉瘤細胞、Lewis肺癌細胞、食管癌和胃癌細胞等的生長都有抑制作用，其作用機制可能與其促進細胞凋亡等有關(guān)[10-11]。中藥炮制是中醫(yī)藥應(yīng)用的關(guān)鍵，茅蒼術(shù)為常見的臨床中藥，其生品燥性較強，多經(jīng)過炮制后應(yīng)用，而目前應(yīng)用最為廣泛的炮制品種是麩炒茅蒼術(shù)[12]。因此，本研究探討茅蒼術(shù)麩炒品在體外對肝癌SMMC-7721細胞活性和凋亡的影響；并建立肝癌SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤模型，觀察茅蒼術(shù)麩炒品在體內(nèi)對肝癌的抑制作用，以及對腫瘤組織中B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)性X蛋白(Bcl-2 associated protein,Bax)和Survivin蛋白表達水平的影響，從而為研究茅蒼術(shù)麩炒品治療肝癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株和實驗動物 SMMC-7721人肝癌細胞購自上海中喬新舟生物科技有限公司(編號ZQ0029)。 無特定病原體級BALB/c裸鼠24只，雌雄各半，4～6周齡，體質(zhì)量約16 g，由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供[合格證號:SCXK(桂)2014-0002]。裸鼠放置在無特定病原體的隔離器中繁殖，飲用經(jīng)過0.2 μm過濾器除菌的超純水。本研究所有動物實驗均符合中國倫理委員會的相關(guān)要求。

1.2 藥品及試劑 茅蒼術(shù)購于三原天域生物制品有限公司；杜氏改良伊戈爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM) 和胎牛血清購于美國Gibco公司(批號：C11995500BT、10099-141)；細胞計數(shù)法(cell count kit-8,CCK-8)試劑盒、結(jié)晶紫染色液、普通RIPA裂解液、二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒和雙抗(青鏈霉素1 ∶100 溶液)購于北京索萊寶科技有限公司(批號：CA1210、 P1400、R0020、PC0020和P1400-100)；細胞凋亡Hoechst染色試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司(批號：C0003)；Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司(批號：550474/559925)；Bcl-2、Bax、Survivin、內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗抗體和二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)購于沈陽萬類生物科技有限公司(批號： WLO1556、WLO1637、WLO3492、WLO1114和WLA023)。

1.3 儀器 Olympus倒置顯微鏡(上海普赫光電公司，型號：IX53)；倒置熒光顯微鏡(廣州市明慧科技有限公司，型號：MHFL-2000)；Varioskan LUX 多功能酶標儀；2000超微量紫外/可見分光光度計(美國Thermo公司)；快速轉(zhuǎn)膜儀和電泳儀(美國Bio-Rad公司，型號：170-4155)；流式細胞儀(貝克曼庫爾特公司，型號：CytoFLEX)；超純水機(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，型號：SmartPlus-E)。

1.4 茅蒼術(shù)工作液的配制 麩炒茅蒼術(shù)為郴州市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科實驗研究中心按照《中國藥典》2010年版[13]中有關(guān)蒼術(shù)的“麩炒法”進行炮制。然后將茅蒼術(shù)麩炒品粉碎，用雙蒸水混懸均勻，置震蕩儀震藥24 h后用一次性的0.45 μm針式過濾器進行過濾，臨用前用超純水稀釋成相應(yīng)的濃度待用。

1.5 細胞實驗

1.5.1 細胞培養(yǎng)：將SMMC-7721細胞置于含10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，在5% CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。

1.5.2 CCK-8法檢測細胞活性：取對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞，接種于96孔板中，每孔體積100 μL，密度為2×103個細胞/孔，將孔板置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞完全貼壁后，每孔加入100 μL含有0 μg/mL(對照組)、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL和600 μg/mL茅蒼術(shù)麩炒品的完全培養(yǎng)液。在37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8試劑(10 μL)；繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度(A)值，并計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(A藥物組-A調(diào)零孔)/(A對照組-A調(diào)零孔)×100%。實驗重復(fù)6次。

1.5.3 細胞形態(tài)學觀察：取對數(shù)生長期SMMC-7721細胞，以每孔5×105個細胞/mL的密度接種于6孔板中，每孔體積2 mL，置于37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長貼壁后，更換為含0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL茅蒼術(shù)麩炒品培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后于Olympus倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化并采集圖片。行Hoechst染色觀察細胞凋亡情況，嚴格按照說明書進行操作，于倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化并采集圖片。

1.5.4 流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡率：取對數(shù)生長期SMMC-7721細胞接種于6孔板中，密度為5×105個/mL，共2 mL，置于37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞完全貼壁后，加入含0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL茅蒼術(shù)麩炒品培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡，嚴格按照Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，計算細胞凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡之和)。實驗重復(fù)3次。

1.6 體內(nèi)實驗

1.6.1 肝癌SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤模型的建立：取SMMC-7721細胞，調(diào)整細胞密度至5×107個細胞/mL，在無菌條件下用1 mL注射器吸取200 μL細胞懸液在每只裸鼠的近腋左背側(cè)皮下進行皮下接種。待腫瘤體積達到100 mm3時，將裸鼠隨機編號后從小到大依次編入模型組和茅蒼術(shù)麩炒品低、中、高劑量組，每組6只，雌雄各半。低、中、高劑量組裸鼠分別每天灌胃(體積1 mL)0.8 g/kg、1.6 g/kg、3.2 g/kg的茅蒼術(shù)麩炒品，模型組灌胃等體積的磷酸緩沖鹽溶液，均1次/d，連續(xù)14 d。實驗期間裸鼠自由飲食飲水，并觀察裸鼠的一般生存狀況。

1.6.2 抑瘤率的計算：末次給藥24 h 后處死各組裸鼠，剝?nèi)∧[瘤組織，稱腫瘤質(zhì)量，并計算抑瘤率[14]。抑瘤率(%)=(1-茅蒼術(shù)麩炒品組平均腫瘤質(zhì)量/模型組平均腫瘤質(zhì)量)×100%。

1.6.3 免疫印跡試驗檢測腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達：末次給藥24 h后處死各組裸鼠，剝?nèi)⌒迈r腫瘤組織稱質(zhì)量后，每20 mg加入RIPA 裂解液150 μL，提取總蛋白。用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。取蛋白樣品 25 μg，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后分離蛋白并轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，用封閉液(5% BSA/TBST)封閉1 h，加 入 一 抗Bcl-2、Bax、Survivin和GAPDH(均1 ∶1 000) ，4℃孵育過夜，TBST 洗膜3次，加入二抗(1 ∶10 000)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL系統(tǒng)顯影。以GAPDH作為內(nèi)參，Image J軟件采集條帶灰度值，取目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 茅蒼術(shù)麩炒品對SMMC-7721細胞活性的影響 與0 μg/mL比較，100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL和600 μg/mL茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)24 h后細胞的存活率均降低(均P<0.05)，而25 μg/mL和50 μg/mL茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)后細胞的存活率與0 μg/mL干預(yù)差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL和600 μg/mL茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)后細胞存活率依次下降(均P<0.05)，見表1。因此，選取茅蒼術(shù)麩炒品100、200和400 μg/mL進行后續(xù)實驗。

表1 不同濃度茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)下SMMC-7721細胞活性(x±s，%)

注：與0 μg/mL比較，*P<0.05；100～600 μg/mL各濃度兩兩比較，均P<0.05。

2.2 茅蒼術(shù)麩炒品對SMMC-7721細胞形態(tài)的影響 0 μg/mL茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)后的細胞排列緊密，呈梭形，形態(tài)飽滿，邊界清楚；而不同濃度茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)后的細胞形態(tài)皺縮，貼壁差，細胞易脫落，且隨著藥物濃度的增加而加重，尤以400 μg/mL組明顯，見圖 1。Hoechst 33258 染色后可見， 0 μg/mL茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)后的細胞形態(tài)一致，細胞核呈正常的藍色，亮度均勻；不同濃度的茅蒼術(shù)麩炒品作用后，細胞核固縮或呈碎裂塊，并且顏色發(fā)白，生成凋亡小體，見圖2。

圖1 不同濃度茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)后的SMMC-7721細胞形態(tài)(×200)

圖2 不同濃度茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)后SMMC-7721細胞的凋亡情況(Hoechst 33258熒光染色，×200)

2.3 茅蒼術(shù)麩炒品對SMMC-7721細胞凋亡率的影響 與0 μg/mL比較，100 μg/mL、200 μg/mL和400 μg/mL茅蒼術(shù)麩炒品作用24 h后細胞凋亡率均增加，且100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)后細胞凋亡率依次升高(均P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)后SMMC-7721細胞凋亡率(x±s，%)

注：與0 μg/mL比較，*P<0.05；與100 μg/mL比較，#P<0.05；與200 μg/mL比較，▲P<0.05。

2.4 茅蒼術(shù)麩炒品對SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤的抑制作用 與模型組比較，各劑量茅蒼術(shù)麩炒品組裸鼠的腫瘤質(zhì)量均降低(均P<0.05)，且茅蒼術(shù)麩炒品低、中、高劑量組裸鼠的腫瘤質(zhì)量依次降低(均P<0.05)，抑瘤率依次升高，見表 3。

表3 不同濃度茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)后SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤質(zhì)量及抑瘤率比較(x±s)

注：與模型組比較，*P<0.05；與茅蒼術(shù)麩炒品低劑量組比較，#P<0.05；與茅蒼術(shù)麩炒品中劑量組比較，▲P<0.05。

2.5 茅蒼術(shù)麩炒品對SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤組織中相關(guān)蛋白表達的影響 與模型組比較，茅蒼術(shù)麩炒品各劑量組的Bcl-2和Survivin蛋白的相對表達水平均降低，Bax蛋白的相對表達水平均升高(均P<0.05)；茅蒼術(shù)麩炒品低、中、高劑量組裸鼠移植瘤的Bcl-2和Survivin蛋白的相對表達水平依次降低，Bax蛋白的相對表達水平依次升高(均P<0.05)。見圖3及表4。

圖3 不同濃度茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)下SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤組織中Bcl-2、Survivin和Bax蛋白表達

表4 不同濃度茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)下SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤組織相關(guān)蛋白的相對表達水平比較(x±s)

注：與模型組比較，*P<0.05；與茅蒼術(shù)麩炒品低劑量組比較，#P<0.05；與茅蒼術(shù)麩炒品中劑量組比較，▲P<0.05。

3 討 論

茅蒼術(shù)是一種普遍存在于自然界中的菊科植物，其性溫而味辛、苦，可以治療痛風、夜盲癥、原發(fā)性高脂血癥和膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病，還具有促進小腸蠕動、保肝、抗缺氧、抗菌抗病毒和降血糖等作用[10，15]。多項研究表明，茅蒼術(shù)具有抑制動物移植性腫瘤、淋巴肉瘤、肺癌、食管癌和胃癌的生長，而這可能與其抑制細胞分裂，進而促進細胞凋亡形成凋亡小體等有關(guān)[6，11-12]。

本研究通過體內(nèi)外實驗分析茅蒼術(shù)的抗肝癌作用。體外實驗結(jié)果顯示，100 μg/mL、200 μg/mL和400 μg/mL的茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)后肝癌SMMC-7721細胞存活率均下降，提示其對肝癌SMMC-7721細胞增殖有抑制作用，且呈濃度依賴作用效應(yīng)。為進一步研究茅蒼術(shù)麩炒品藥物干預(yù)后細胞凋亡和增殖的情況，本研究選取100、200和400 μg/mL濃度梯度進行后續(xù)的實驗。

有文獻報告，茅蒼術(shù)通過絲裂原活化蛋白激酶激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和核因子κB途徑抑制非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549和NCI-H1299細胞增殖并誘導其凋亡，進而發(fā)揮抗腫瘤作用[11]。另一研究表明，茅蒼術(shù)提取物能夠抑制胃癌細胞的分裂分化，進而促進細胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)后，可以觀察到肝癌SMMC-7721細胞形態(tài)皺縮，貼壁差，細胞極易脫落；Hoechst 33258 染色后可見，不同濃度的茅蒼術(shù)麩炒品作用后細胞核固縮或呈碎裂塊，并且顏色發(fā)白，生成凋亡小體；流式細胞術(shù)結(jié)果亦顯示，不同劑量茅蒼術(shù)麩炒品干預(yù)后肝癌SMMC-7721細胞凋亡率升高，且隨藥物濃度增大而依次增加(P<0.05)。這些結(jié)果與CCK-8實驗結(jié)果一致，表明茅蒼術(shù)麩炒品可以誘導肝癌細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

茅蒼術(shù)麩炒品體外抗肝癌實驗結(jié)果顯示，給藥14 d后，各劑量茅蒼術(shù)麩炒品組裸鼠的腫瘤質(zhì)量均低于模型組，且隨著藥物濃度的增加腫瘤質(zhì)量依次降低(均P<0.05)，抑瘤率依次升高，其中茅蒼術(shù)麩炒品高劑量組的抑瘤率達到73.02%。

Bcl-2蛋白是凋亡研究中關(guān)鍵的癌基因之一[16]，其機制主要是調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性，從而抑制細胞凋亡[17]。Bax是促進凋亡的蛋白，其過度表達可抵抗Bcl-2的保護效應(yīng)而使細胞凋亡[18]。Survivin也是凋亡蛋白，其過表達與腫瘤細胞的分裂分化，促進腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[19]。研究表明，肝癌患者癌組織中Survivin mRNA和蛋白的表達均高于癌旁組織[20]。我們進一步取新鮮腫瘤組織檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達，實驗結(jié)果顯示各劑量茅蒼術(shù)麩炒品組中Bcl-2和Survivin蛋白表達水平明顯下調(diào)，Bax蛋白表達水平明顯增加(均P<0.05)。因此，茅蒼術(shù)麩炒品可能是通過下調(diào)腫瘤組織中Bcl-2和Survivin蛋白表達，上調(diào)Bax蛋白表達，從而抑制裸鼠移植瘤生長。

綜上所述，茅蒼術(shù)麩炒品能抑制肝癌SMMC-7721細胞增殖并誘導其凋亡；同時茅蒼術(shù)麩炒品能夠抑制裸鼠移植瘤腫瘤的生長，其機制可能與其上調(diào)Bax蛋白表達和下調(diào)Bcl-2和Survivin蛋白表達有關(guān)。