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        探討低劑量地西他濱對CD4陽性T細(xì)胞功能的影響

        2020-07-08 04:11:38郭業(yè)磊代漢仁陳德云韓為東
        關(guān)鍵詞:倍數(shù)表型甲基化

        韓 笑,郭業(yè)磊,代漢仁,佟 川,陳德云,王 瑤,韓為東

        解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 生物治療病區(qū)/分子免疫室,北京 100853

        長期以來基因組突變一直被認(rèn)為是腫瘤形成的核心因素,但是近些年的研究表明,表觀遺傳機制在腫瘤疾病的進展中同樣發(fā)揮了重要的作用[1]。DNA甲基化、組蛋白修飾以及非編碼RNA調(diào)節(jié)等是表觀遺傳修飾的主要機制,因此靶向或逆轉(zhuǎn)表觀遺傳修飾已經(jīng)成為了極具潛力的腫瘤治療方法[2-3]。其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(DNA methyltransferase inhibitor,DNMTi)能夠發(fā)揮對DNMTs抑制的表觀遺傳效應(yīng)而產(chǎn)生抗腫瘤作用。雖然DNMTi對腫瘤抑制基因重新激活的研究更為廣泛,但有證據(jù)表明DNMTs的抑制會產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞外的免疫調(diào)節(jié)作用。去甲基化修飾對于T細(xì)胞的耗竭至關(guān)重要,其能夠抑制耗竭T細(xì)胞中效應(yīng)細(xì)胞功能、增殖、代謝活性和組織歸巢所涉及的關(guān)鍵基因[4-6]。最新研究也證實DNA甲基化促進了T細(xì)胞耗竭并限制了PD-1抑制劑的療效,而DNA去甲基化則增強了PD-1抑制劑介導(dǎo)的T細(xì)胞再生[7]。目前有關(guān)DNMTi的研究更多集中在腫瘤細(xì)胞、T細(xì)胞以及CD8陽性T細(xì)胞亞群,對CD4陽性T細(xì)胞的研究報道較少[8-10]。去甲基化藥物地西他濱(5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷;decitabine,DAC)是一種獨特的胞嘧啶類似物,能抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,逆轉(zhuǎn)甲基化,并能在體內(nèi)和體外重新激活表觀遺傳沉默的基因[11-12]。本研究采用體外添加DAC對CD4陽性T細(xì)胞進行修飾,觀察其對CD4陽性T細(xì)胞增殖、記憶以及細(xì)胞毒性的影響,為地西他濱增強CD4陽性T細(xì)胞抗腫瘤功能的研究提供探索方向。

        材料與方法

        1 實驗細(xì)胞 Raji細(xì)胞(人Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞系,美國ATCC)。

        2 主要試劑和儀器 PBS緩沖液,Buffer緩沖液(PBS+0.5%人血清白蛋白+2 mmol/L EDTA),人外周血淋巴細(xì)胞分離液,X-VIVO15培養(yǎng)基(瑞士 Lonza),IL-2(美國 PeproTech),CD3單克隆抗體(日本Takara),磁力分選柱,人類CD4+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒(德國Miltenyi),人IL-2、FasL、IFN-γ以及TNF-αValukineTMELISA試劑盒(美國NOVUS),流式細(xì)胞抗體CD3-APC、CD4-FITC、CD8-PerCP、CD45RO-APC、CD62L-PE,醫(yī)用離心機(中國北京京立離心機),流式細(xì)胞儀(美國Beckman),個人型細(xì)胞分析儀(韓國NanoEntek),多功能酶標(biāo)儀VarioskanTMLUX(美國Thermo Fisher),CO2培養(yǎng)箱。

        3 提取外周血淋巴細(xì)胞 采集3名25 ~ 30歲男性健康供者靜脈血各60 ml(均取得健康供者知情同意),置于抗凝管中,輕輕搖勻,取6個50 ml離心管各加入淋巴細(xì)胞分離液15 ml,然后沿管壁緩緩加入0.9%氯化鈉注射液稀釋的靜脈血各35 ml,20℃、2 000 r/min離心20 min,吸取中間環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層,PBS緩沖液洗兩遍。

        4 分選CD4+T淋巴細(xì)胞 將上述外周血淋巴細(xì)胞計數(shù),每107個細(xì)胞重懸于40μl Buffer緩沖液,并加入10μl Biotin-Antibody Cocktail,混勻放入4℃冰箱5 min,加入30μl Buffer及20μl Anti-Biotin MicroBeads充分混勻放入4℃冰箱10 min。將磁力柱吸附于磁力架上,用3 ml Buffer沖洗磁力柱,將上述制備好的細(xì)胞懸液加入磁力柱中收集流出的細(xì)胞即CD4+T細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分析CD4+T細(xì)胞的分選效率。

        5 細(xì)胞培養(yǎng) 磁珠分選出的CD4+T細(xì)胞直接懸浮在于含有anti-CD3mAb(500 ng/μl)和IL-2(300 U/ml)的培養(yǎng)基中,放置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中。3 d后將細(xì)胞移至新的培養(yǎng)瓶中懸浮培養(yǎng),每3 d添加新鮮的培養(yǎng)基及IL-2。

        6 細(xì)胞增殖實驗 細(xì)胞共分為6組,每組6孔。初始細(xì)胞數(shù)1×105/孔,其中CD4+T細(xì)胞組作為對照組,其他各組按照10 nmol/L、30 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L和1 000 nmol/L添加DAC。分別于3 d、7 d、10 d和14 d使用個人型細(xì)胞分析儀進行細(xì)胞計數(shù),以細(xì)胞數(shù)/初始細(xì)胞數(shù)作為細(xì)胞增殖倍數(shù)。通過不同濃度DAC對細(xì)胞增殖的影響,篩選出促進增殖最佳的最低劑量組。按照上述實驗分組,分別在不同的時間點即0 d、1 d、2 d、5 d和7 d添加DAC,同樣的方法在3 d、7 d、10 d和14 d計算細(xì)胞增殖倍數(shù),篩選出促進增殖最佳的時間組,并最終確定添加DAC的最佳劑量和時間,為后續(xù)實驗做準(zhǔn)備。

        7 細(xì)胞表型檢測 上述各組細(xì)胞在7 d時用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型,以CD45RO+CD62L+作為中央記憶型T細(xì)胞(central memory Tcell,TCM),以CD45RO-CD62L+作為干細(xì)胞樣中央記憶型T細(xì)胞(stem cell-like memory Tcell,TSCM)。

        8 腫瘤細(xì)胞殺傷實驗 采用基于阻抗的腫瘤細(xì)胞殺傷試驗(xCELLigence)來檢測靶細(xì)胞的持續(xù)溶解。Raji細(xì)胞被電鍍在96孔電阻底板中,每孔5×103個細(xì)胞。24 h后,加入5×104個效應(yīng)細(xì)胞。共分3組,每組6孔,包括DAC處理的CD4+T細(xì)胞+Raji細(xì)胞組、CD4+T細(xì)胞+Raji細(xì)胞(對照組)以及不添加效應(yīng)細(xì)胞的Raji細(xì)胞組。每15 min集測量1次基于阻抗的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞指數(shù),監(jiān)測時間為96 h。標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞指數(shù)則通過測量由Raji腫瘤細(xì)胞黏附引起的晶體管平板上的電流阻抗確定。

        9 細(xì)胞因子檢測 細(xì)胞分2組,每組6孔,細(xì)胞數(shù)5×105/孔,包括DAC處理的CD4+T細(xì)胞和對照組CD4+T細(xì)胞。各組細(xì)胞培養(yǎng)7 d時,分別加入Raji細(xì)胞,細(xì)胞數(shù)5×104/孔。24 h后使用ELISA試劑盒和多功能酶標(biāo)儀檢測IL-2、FasL、IFN-γ和TNF-α的分泌。

        10 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS22.0進行研究資料分析。觀測資料主要為計量數(shù)據(jù),均通過正態(tài)性檢驗,以-x±s描述。兩組間的比較為成組t檢驗或校正t檢驗(統(tǒng)計量為t),多組比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

        結(jié) 果

        1 CD4+T細(xì)胞的分選效率 通過人類CD4+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒和磁力柱對人外周血淋巴細(xì)胞進行分選,磁力柱中流出來的細(xì)胞即CD4+T細(xì)胞,經(jīng)過流式細(xì)胞儀分析CD4+T細(xì)胞的分選效率為95.36% ~ 97.51%,能夠達到實驗所需要的純度(流式代表圖見圖1)。

        圖1 分選CD4+ T細(xì)胞Fig. 1 Selection of CD4+ subsets from Tcells

        2 添加DAC的最低劑量及最佳時間 通過不同劑量和添加時間篩選出促進CD4+T細(xì)胞增殖最佳的DAC劑量和時間:1)劑量:5種不同劑量DAC實驗結(jié)果提示,3 d時各組細(xì)胞均出現(xiàn)增殖,其中200 nmol/L和1 000 nmol/L組細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著低于對照組(P<0.05),其他各組和對照組細(xì)胞的增殖倍數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。7 d時各組與對照組細(xì)胞的增殖倍數(shù)差異顯著,其中10 nmol/L、30 nmol/L和100 nmol/L組細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著高于對照組(P<0.05),200 nmol/L和1 000 nmol/L組細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)。10 d時各組間細(xì)胞增殖均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。14 d時10 nmol/L、30 nmol/L和100 nmol/L組細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著高于對照組(P<0.05),200 nmol/L和1 000 nmol/L組細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)。由此篩選出促進細(xì)胞增殖效果最佳的最低DAC劑量為10 nmol/L,并作為后續(xù)實驗的使用劑量(圖2A)。2)時間:確定DAC添加實驗劑量后,進一步實驗探索DAC添加時間:分別在5個不同的時間點添加10 nmol/L DAC。結(jié)果顯示,3 d時各時組間的細(xì)胞增殖均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。7 d、10 d和14 d時,Day0、Day1和Day2組的細(xì)胞增殖倍數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05),而Day5和Day7組細(xì)胞增殖倍數(shù)與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。另外,Day0、Day1和Day2組的組間細(xì)胞增殖倍數(shù)以及Day5和Day7組的組間細(xì)胞增殖倍數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異。通過實驗證實,在細(xì)胞培養(yǎng)3 d以后添加DAC,幾乎不再影響細(xì)胞的增殖。因此,由此最終確定了添加DAC的最低劑量和最佳時間為10 nmol/L、Day 0(圖2B)。

        3 DAC修飾的CD4+T細(xì)胞的記憶表型增強 7 d時檢測記憶細(xì)胞表型(CD45RO,CD62L)。結(jié)果顯示,TCM表型(CD45RO+CD62L+)較對照組顯著增加(P<0.001),TSCM表型(CD45RO-CD62L+)較對照組也顯著增加(P<0.05)。結(jié)果提示DAC有助于提高CD4+T細(xì)胞記憶性,中央記憶型T細(xì)胞以及干細(xì)胞樣中央記憶型T細(xì)胞的比例增加最為顯著(圖3)。

        圖2 不同劑量和時間點添加DAC對CD4+ T細(xì)胞增殖的影響(aP<0.05; n=3)A: 不同劑量; B: 不同時間Fig. 2 Effect of adding DAC at different doses and time points on the proliferation of CD4+ Tcells (aP<0.05; n=3)A: Different doses; B: Different time points

        圖3 低劑量DAC對CD4+ T細(xì)胞記憶表型的影響Fig. 3 Effect of low-dose DAC on memory phenotype of CD4+ Tcells (aP<0.05; bP<0.001;n=3)

        圖5 低劑量DAC對CD4+ T細(xì)胞接觸腫瘤抗原后細(xì)胞因子分泌能力的影響Fig. 5 Effect of low-dose DAC on cytokine secretion of CD4+ Tcells exposed to tumor antigen (aP<0.05; bP<0.001;n=3)

        4 DAC修飾的CD4+T細(xì)胞腫瘤溶解能力增強 通過xCELLigenceⅠ阻抗系統(tǒng)進行96 h效靶比(E∶T)為10∶1的殺傷實驗,結(jié)果顯示DAC修飾的CD4+T細(xì)胞腫瘤溶解能力優(yōu)于對照組,說明DAC能夠維持CD4+T細(xì)胞持續(xù)抑制腫瘤的能力(圖4)。

        5 DAC修飾的CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌增強將培養(yǎng)7 d的效應(yīng)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞按照10∶1的比例進行共培養(yǎng),24 h后收集培養(yǎng)上清進行ELISA檢測。結(jié)果顯示,DAC修飾后的CD4+T細(xì)胞與Raji細(xì)胞共培養(yǎng)后其分泌的IL-2、FasL、IFN-γ以及TNF-α顯著高于對照組,說明DAC修飾的CD4+T細(xì)胞遇到抗原后,分泌細(xì)胞因子的能力增強,而這些細(xì)胞因子可以促進T細(xì)胞增殖及增強細(xì)胞毒性(圖5)。

        討 論

        T淋巴細(xì)胞在抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用,以T細(xì)胞為主的過繼性免疫細(xì)胞在腫瘤免疫治療領(lǐng)域也越來越受到重視。雖然T細(xì)胞相關(guān)的過繼性免疫治療需要經(jīng)過體外的擴增培養(yǎng)或基因工程化改造,但是主要分群仍然是CD4+和CD8+T細(xì)胞,兩者相互協(xié)調(diào)共同發(fā)揮抗腫瘤功效[13-14]。幼稚CD4+T細(xì)胞可以根據(jù)特征性效應(yīng)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子分化為不同輔助性T細(xì)胞(Th),CD4+T細(xì)胞的持續(xù)性和記憶性是T細(xì)胞體內(nèi)長時間抗腫瘤的關(guān)鍵[15]。CD8+T細(xì)胞是T細(xì)胞發(fā)揮腫瘤殺傷作用的主要細(xì)胞群,但是缺失CD4+T細(xì)胞的幫助會導(dǎo)致嚴(yán)重的CD8+T細(xì)胞耗竭[16]。因此,如果能夠體外增強CD4+T細(xì)胞的功能,可能是提高過繼免疫細(xì)胞療效的關(guān)鍵。

        本研究探索了5種不同劑量和5個不同時間點添加DAC對CD4+T細(xì)胞增殖的影響。實驗結(jié)果顯示,高劑量的DAC,尤其是超過200 nmol/L劑量時,在體外培養(yǎng)過程中會降低CD4+T細(xì)胞的增殖。在1 000 nmol/L時,T細(xì)胞會出現(xiàn)大量的死亡。在10 ~ 100 nmol/L劑量范圍內(nèi),DAC能夠促進CD4+T細(xì)胞的增殖。值得注意的是,無論是CD4+還是CD8+T細(xì)胞,來自中央記憶型T細(xì)胞亞群比效應(yīng)記憶型T細(xì)胞亞群具有更加持續(xù)性的抗腫瘤能力[13,17-18]。本研究證實,DAC修飾的CD4+T細(xì)胞TCM表型以及TSCM表型顯著增加。

        圖4 低劑量DAC對CD4+T細(xì)胞持續(xù)抑制腫瘤能力的影響Fig. 4 Effect of low-dose DAC on long-term tumor inhibition ability of CD4+ Tcells(n=3)

        當(dāng)T細(xì)胞處于耗竭狀態(tài)時,其分泌的細(xì)胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ等降低,從而降低了細(xì)胞的溶解及增殖能力[19]。本研究通過ELISA檢測效應(yīng)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞因子的分泌結(jié)果提示,DAC組的IL-2、FasL、IFN-γ以及TNF-α較對照組顯著增高。IL-2是促進T細(xì)胞增殖的關(guān)鍵細(xì)胞因子,而FasL、IFN-γ以及TNF-α則是T細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用的關(guān)鍵細(xì)胞因子。DAC不但能夠促進細(xì)胞增殖相關(guān)的細(xì)胞因子分泌,同時還能夠促進細(xì)胞毒相關(guān)的細(xì)胞因子分泌,與相關(guān)研究觀察到DNA去甲基化能夠增強體內(nèi)IL-2及INF-γ分泌的結(jié)果相符[10,20-21]。在細(xì)胞因子分泌增多的同時,本研究觀察到了DAC修飾的T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞殺傷作用的增強。CD8+T細(xì)胞是發(fā)揮抗腫瘤作用的主要作用細(xì)胞,CD4對與腫瘤細(xì)胞的殺傷作用很弱。但本研究觀察到,在DAC處理后CD4的抗腫瘤能力有了明顯的提高,雖然無法達到100%清除腫瘤細(xì)胞能力,但相對于未修飾CD4+T細(xì)胞,DAC修飾后的CD4+T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞發(fā)揮了長效抑制作用。

        綜上所述,本實驗結(jié)果提示,低劑量DAC能夠顯著促進CD4+T細(xì)胞增殖和記憶表型,并提高持續(xù)抑制腫瘤細(xì)胞增長和分泌細(xì)胞因子的能力。在此研究基礎(chǔ)上,我們將進一步通過動物實驗驗證DAC修飾的T細(xì)胞的抗腫瘤功效,進行基因組學(xué)水平分析探索DAC對CD4+T細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子以及信號通路等的影響。

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