史宜正，劉 毅，徐志鵬，傅 強

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 麻醉手術(shù)中心，北京 100853

血腦屏障(biood brain barrier，BBB)是由腦微血管內(nèi)皮細胞、基膜、星形膠質(zhì)細胞足突以及細胞間緊密連接(tight junction，TJs)組成的重要結(jié)構(gòu)。一旦遭到破壞，外界的有害物質(zhì)極易進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變[1-3]。鑒于體內(nèi)血腦屏障觀察的不便性，體外血腦屏障模型對多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究具有重要意義。目前已有多種建立體外血腦屏障的方法[4-5]，如體外培養(yǎng)單層腦內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮細胞與星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)，研究表明單獨培養(yǎng)內(nèi)皮細胞的模型會喪失血腦屏障部分功能，而與星形膠質(zhì)細胞聯(lián)合培養(yǎng)則可恢復(fù)部分功能[6]，可見星形膠質(zhì)細胞在誘導(dǎo)血腦屏障發(fā)揮特性中起重要作用。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性細菌細胞壁外壁的組成成分，腹腔或局部腦室注射LPS可以促進腦內(nèi)炎性因子的釋放及神經(jīng)元凋亡，常用來模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)[7-8]。本實驗通過建立體外血腦屏障模型，并利用LPS進行處理，模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，探究其對血腦屏障功能的影響，為進一步探究血腦屏障在中樞炎癥產(chǎn)生機制中的作用提供思路。

材料與方法

1 實驗動物 出生1 ～ 3 d C57BL乳鼠，雌雄不限，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物許可證編號：SCXK(京)2014-0004。

2 設(shè)備與試劑 二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-170AIUVL-PC)，超凈臺(北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司)，倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，冷恒溫振蕩器(太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司)，上皮電阻電壓儀RE1600(中國北京金工鴻泰科技有限公司 )，Mini Gel Tank(美國 Invitrogen 公司 )，電泳儀電源(DYY-5D中國北京六一儀器廠)，脫色搖床(WD-94505D中國北京六一生物科技有限公司)，化學(xué)發(fā)光儀(中國北京西沖生物科技有限 公 司 )，NuPAGETM4-12% Bis-Tris Gel(美 國Invitrogen公司 )，Transwell小室 (美國 Coring公司)，bEND.3小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞(武漢普諾賽生物科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司 )，Phosphote Buffered Saline(美國 HyClone公司)，胎牛血清(德國PAN公司)，鏈霉素/青霉素(美國HyClone公司)，胰蛋白酶(美國Gibco公司)，內(nèi)皮細胞培養(yǎng)套裝(美國Sigma公司)，DifoTMSkim Milk(美國BD公司)兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白多克隆抗體(美國Sigma公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(美國Jackson ImmunoReaserarch公司)，脂多糖(美國Sigma公司)，NuPAGE MOPS SDS Running Buffer(美 國 Invitrogen公 司 )，NuPAGE Transfer Buffer(美國 Invitrogen公司 )，RIPA 高效裂解液(美國Solarbio公司)，兔抗小鼠Occludin抗體(美國Abcom公司)，兔抗小鼠ZO-1抗體(美國Invitrogen公司)，兔抗小鼠GADPH抗體(美國Abcom公司)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(中國武漢博士德生物工程有限公司)。

3 bEND.3小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng) 鏡下觀察bEND.3小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞生長狀態(tài)后置于二氧化碳孵育箱中穩(wěn)定3 h以進行傳代處理。吸取培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，加入一定量的0.25%胰蛋白酶消化3 min。消化成功后加入等量的內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)基(DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+5% PS)重懸混勻后置于離心機以1 200 r/min離心5 min。去除上清加入10 ml內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)基重懸混勻后傳至2個25 cm2培養(yǎng)瓶中，每隔2 d換液以備后續(xù)實驗使用。

4 小鼠原代星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng) 將出生1 ～ 3 d的10只C57BL乳鼠用75%乙醇消毒全身后，斷頭取腦。所取腦組織放入預(yù)冷PBS中并去除軟腦膜、海馬及其他腦組織部分，剩余皮質(zhì)部分放入新EP管內(nèi)。使用1 000μl槍頭反復(fù)吹打3次組織后轉(zhuǎn)移至15 ml離心管內(nèi)加入8 ml 0.25%胰蛋白酶，37℃恒溫振蕩消化30 min。完全消化后加入等量星形膠質(zhì)細胞完全培養(yǎng)基(DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1% PS)終止消化。以1 200 r/min離心5 min后去除上清，加入完全培養(yǎng)基重懸后種于2個25 cm2培養(yǎng)瓶中。24 h后換液，此后可每2 d換液[9-10]。7 ～ 8 d后，星形膠質(zhì)細胞匯聚，小膠質(zhì)細胞覆蓋于星形膠質(zhì)細胞層之上，此時將培養(yǎng)瓶置于恒溫搖床上180 r/min搖晃30 min。去除含有小膠質(zhì)細胞的上清，換液后在孵箱穩(wěn)定1 h后繼于恒溫搖床上續(xù)以240 r/min搖晃6 h，然后人工劇烈搖晃1 min，以去除含有少突膠質(zhì)前體細胞的上清。鏡下觀察細胞生存狀態(tài)后用胰蛋白酶消化貼壁細胞，種于新培養(yǎng)板內(nèi)以備后續(xù)實驗使用。

5 流式細胞術(shù)鑒定星形膠質(zhì)細胞 通過檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達以判斷星形膠質(zhì)細胞陽性率。待測細胞根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果加入PBS充分重懸后等量放于兩個流式管內(nèi)，一組加入兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白多克隆抗體(1∶500)，另一組加入等量PBS，室溫避光孵育30 min。一抗孵育結(jié)束后1 200 r/min離心5 min去上清，加入PBS再次重懸清洗兩次。清洗結(jié)束后加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶100)室溫避光孵育30 min。孵育結(jié)束后使用PBS清洗細胞兩次后上機檢測。

6 體外血腦屏障模型的建立 將上述培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細胞以2.75×104/孔的細胞密度種于Transwell小室背面，倒置培養(yǎng)3 h后加入500μl星形膠質(zhì)細胞完全培養(yǎng)基并正置培養(yǎng)2 d后，以6.6×104/孔的細胞密度將內(nèi)皮細胞種于小室內(nèi)。1 ～ 2 d更換兩種細胞培養(yǎng)基使其穩(wěn)定生長待后續(xù)處理。

7 4 h液面滲漏試驗 更換Transwell小室內(nèi)外側(cè)培養(yǎng)基，使內(nèi)外側(cè)液面相差＞0.5 cm，放置二氧化碳孵箱孵育4 h后再次測量液面差，若4 h后液面仍相差＞0.5 cm(波動浮動＜0.1 cm)，則可初步判斷體外血腦屏障模型建立成功。

8 跨內(nèi)皮細胞電阻(trans-epithelium electrical resistant，TEER)測定 待Transwell小室中微血管內(nèi)皮細胞接種7 d后，采用中國北京金工鴻泰科技有限公司提供的上皮電阻電壓儀檢測TEER值，方法遵循說明書。TEER值可反映小離子通透物理屏障的電阻抗，是測定血腦屏障完整性敏感準(zhǔn)確的指標(biāo)，TEER值下降說明血腦屏障完整性下降，遭到破壞。

9 脂多糖處理方法 實驗共分為三種細胞：bEND.3小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞、原代星形膠質(zhì)細胞和共培養(yǎng)模型細胞。每種細胞均分為兩組：對照組和LPS處理組。每組細胞更換新鮮無血清培養(yǎng)基后LPS處理組以20μg/ml的藥物濃度處理24 h，對照組則加入等量PBS。24 h后收集細胞待后續(xù)實驗使用。

10 Western Blot檢測血腦屏障相關(guān)蛋白Occludin、ZO-1相對蛋白表達量 每組細胞經(jīng)LPS處理完畢后使用預(yù)冷PBS進行清洗3次，吸凈所有液體后均加入100μl RIPA高效裂解液進行細胞蛋白提取，冰上裂解10 min利用細胞刮匙收集細胞，4℃12 500 g 15 min取上清。使用BCA法測定細胞濃度后，PBS稀釋細胞蛋白濃度至2μg/μl。蛋白經(jīng)過10 min 70℃變性冷卻后備用。利用Mini Gel Tank電泳系統(tǒng)進行電泳，每孔上樣量為10μl，電泳條件為4℃150 mA 90 min，待目的條帶分離開后利用Mini Gel Tank轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為4℃ 250 mA 1 h。轉(zhuǎn)膜成功后使用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，封閉結(jié)束后使用TBST清洗PVDF膜后分別孵育三種一抗：GADPH兔抗小鼠一抗(1∶1 000)、Occludin兔抗小鼠一抗(1∶1 000)和ZO-1兔抗小鼠一抗(1∶1 000)。4℃過夜孵育后，TBST清洗PVDF膜3次，每次10 min，加入山羊抗兔IgG(H+L)多克隆抗體(1∶5 000)，室溫孵育1 h。TBST清洗PVDF膜3次，每次5 min?；瘜W(xué)增強發(fā)光法(ECL)顯色，所得條帶使用Image J進行灰度值分析，以目的蛋白的灰度值與GADPH的灰度值之比半定量分析目的蛋白表達量。

11 統(tǒng)計學(xué)處理 使用Graphpad7.0進行統(tǒng)計及作圖，所有數(shù)據(jù)以-x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)鑒定 培養(yǎng)1 d后即可觀察到少許貼壁細胞有粗短伸展，3 ～ 4 d后細胞即可長滿60%，形態(tài)呈不規(guī)則狀，胞體肥大，邊界清晰，相互連接成網(wǎng)狀。7 d后細胞可鋪滿呈片，經(jīng)過提純后可觀察部分細胞脫落，貼壁細胞胞體較大，可呈三角形、梭形等不規(guī)則形態(tài)；突起粗短符合星形膠質(zhì)細胞形態(tài)(圖1)。流式細胞術(shù)鑒定后，96%細胞為陽性細胞(圖2)。

圖1 倒置顯微鏡下小鼠原代星形膠質(zhì)細胞(200倍)Fig. 1 Morphology of primary astrocytes in mice under inverted microscope (200×)

2 體外血腦屏障模型建立鑒定 1) 4 h液面滲漏試驗結(jié)果：4 h孵育后，Transwell小室內(nèi)外側(cè)仍可觀察到明顯的液面差＞0.5 cm，說明細胞層間形成屏障，初步判斷血腦屏障模型建成(圖3)。2)單層培養(yǎng)的微血管內(nèi)皮細胞TEER值為(26.00±0.28) Ωcm2(n=5)，微血管內(nèi)皮細胞與原代星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)模型TEER值為(34±0.82) Ωcm2(n=5)，明顯高于單層培養(yǎng)微血管內(nèi)皮細胞。

3 三種細胞分別經(jīng)LPS處理后TEER測定 與對照組相比，三種細胞分別經(jīng)LPS處理后TEER值均顯著降低(P＜0.05)(表1)。

4 三種細胞分別經(jīng)LPS處理后Occludin、ZO-1蛋白相對表達量 與對照組相比，三種細胞分別經(jīng)LPS處理后與Occludin、ZO-1蛋白相對表達量均有顯著降低(P＜0.05)(圖4、圖5)。

圖2 流式細胞學(xué)分析小鼠原代星形膠質(zhì)細胞純度Fig. 2 Flow cytometry analysis of primary astrocyte purity in mice

圖3 4 h液面滲漏試驗前(A)、 試驗后(B)結(jié)果Fig. 3 Result of liquid level leakage test at 4 h A： Before liquid level leakage test； B： After liquid level leakage test

表1 三種細胞分別經(jīng)LPS處理后TEER測量結(jié)果Tab. 1 TEER measurement results of three types of cells in the control group and the LPS group (Ωcm2)

圖4 Western blot檢測LPS處理后三種細胞Occludin蛋白相對表達量(aP＜0.05， vs對照組， n=6)Fig.4 Relative expression of Occludin in three types of cells treated with LPS by western blot (aP＜0.05, vs control, n=6)

圖5 Western blot檢測LPS處理后三種細胞ZO-1蛋白相對表達量(aP＜0.05， bP＜0.01， vs 對照組， n=6)Fig. 5 Relative expression of ZO-1 in three types of cells treated with LPS by western blot (aP＜0.05, bP＜0.01, vs control, n=6)

討 論

血腦屏障在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境中發(fā)揮重要作用，研究表明許多神經(jīng)系統(tǒng)病變均與血腦屏障改變密切相關(guān)[11-12]。因而體外建立血腦屏障模型對研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制具有重要意義。本實驗將腦微血管內(nèi)皮細胞與星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)于Transwell小室的培養(yǎng)方法構(gòu)建的血腦屏障模型，更接近體內(nèi)血腦屏障結(jié)構(gòu)及功能，更具有臨床意義。星形膠質(zhì)細胞原代分離培養(yǎng)大多采用消化法分離[9]。本實驗同樣采用相同方法對星形膠質(zhì)細胞進行分離，并且僅用0.25%胰蛋白酶進行消化，同時根據(jù)多次預(yù)實驗結(jié)果，在消化期間采用恒溫37℃振蕩消化細胞而非傳統(tǒng)水浴鍋，可在一定程度上減少細菌污染的可能性，后經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定細胞純度為96%，滿足共培養(yǎng)要求。在動物模型中，血腦屏障通透性常利用尾靜脈注射伊文思藍后進行檢測，或電鏡下直接觀察血腦屏障結(jié)構(gòu)改變。而在建立體外血腦屏障模型時，為了可以簡捷、準(zhǔn)確判斷模型是否成功，4 h液面滲透試驗是較常使用方法，若4 h前后Transwell內(nèi)外液面可保持基本不變，則可初步判斷體外血腦屏障模型的成功建立?？鐑?nèi)皮細胞電阻同樣可以準(zhǔn)確、便捷地評價血腦屏障緊密連接功能，數(shù)值越大，血腦屏障功能越好[13-14]。本實驗結(jié)果顯示，bEND.3小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞與原代小鼠星形膠質(zhì)細胞構(gòu)成的共培養(yǎng)模型TEER為(34.00±0.82) Ωcm2，而單層bEND.3小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞TEER僅為(26.00±0.82) Ωcm2，可進一步說明共培養(yǎng)模型已成功建立。

原代小鼠星形膠質(zhì)細胞、bEND.3小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞及共培養(yǎng)模型細胞三種細胞分別經(jīng)LPS處理后，與各自對照組相比，TEER值均降低(P＜0.05)說明LPS處理后引起血腦屏障功能受損。細胞間緊密連接作為構(gòu)成血腦屏障的另一主要結(jié)構(gòu)，通過諸多研究表明緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)、分布及含量的變化均會影響TJs，從而影響血腦屏障通透性[15]。咬合蛋白Occudin和胞質(zhì)附著蛋白ZO-1則是其中兩種經(jīng)典且重要的緊密連接蛋白，兩者相互連接形成TJs基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)[16]。Occudin是構(gòu)成TJs的基礎(chǔ)蛋白之一，其主要是柵欄功能和細胞旁屏障功能[17]，其表達水平降低可直接破壞TJs的穩(wěn)定性，導(dǎo)致血腦屏障功能的降低。胞質(zhì)附著蛋白ZO-1同樣是維持TJs結(jié)構(gòu)完整穩(wěn)定主要蛋白之一，其表達水平下降同樣也標(biāo)志著血腦屏障功能的降低[18]。本實驗發(fā)現(xiàn)，原代小鼠星形膠質(zhì)細胞、bEND.3小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞及共培養(yǎng)模型細胞分別經(jīng)LPS處理后，與對照組相比Occudin、ZO-1蛋白表達量均顯著下降(P＜0.05)，進一步說明LPS處理后會破壞血腦屏障功能。

LPS作用于細胞膜表面的Toll樣受體(Tolllike receptor 4)引起中樞、外周細胞因子升高同時激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，引起的體內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)釋放大量炎性因子如IL-1β、IL-6、TNF等[19-21]。多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默病、會不斷促進炎性因子的釋放，產(chǎn)生慢性炎癥，不斷損傷神經(jīng)元，破壞神經(jīng)系統(tǒng)功能[22-25]，可以說中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病共同的病理生理改變，明確中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生機制可以為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新思路。血腦屏障作為隔絕中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外界的天然屏障，是否在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生中起重要作用目前無定論。根據(jù)本實驗結(jié)果，組成血腦屏障微血管內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞較對照組TEER值均明顯降低，Occludin和ZO-1兩種血腦屏障相關(guān)連接蛋白表達量也明顯下降，說明LPS誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)可能首先影響這兩種組成血腦屏障結(jié)構(gòu)的細胞，破壞TJs完整性及穩(wěn)定性，影響其生理結(jié)構(gòu)后導(dǎo)致整個血腦屏障功能減弱，而血腦屏障功能減弱是否會加劇中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的進展，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的產(chǎn)生，值得進一步研究。

總之，LPS誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)會降低血腦屏障跨內(nèi)皮細胞電阻及血腦屏障相關(guān)連接蛋白表達量，削弱血腦屏障功能。