樊慧杰 柴 智 陳樂樂 黃浩楹 弓 強 殷福棟

（山西中醫(yī)藥大學(xué)， 山西 晉中030619）

苦參Sophora flavescensAit.為豆科槐屬植物，距今有兩千多年的藥用歷史，最早記載見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品。2015 年版《中國藥典》 規(guī)定藥用苦參為其干燥根，春、秋二季采挖，除去根頭和小支根，洗凈干燥即可?？鄥⑽犊?、性寒，歸心、肝、胃、大腸、膀胱經(jīng)，有清熱燥濕、殺蟲、利尿等作用，主治熱痢、便血、黃疸尿閉、赤白帶下、陰腫陰癢、濕疹、濕瘡、皮膚瘙癢、疥癬麻風(fēng)等病癥［1］。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)苦參含有較為豐富的化合物，其中活性成分以生物堿類和黃酮類為主，具有多種藥理作用，如抗腫瘤［2］、抗心律失常［3］、抗病毒［4-5］、抑菌［6］、抗肝損傷［7］、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)［8］以及調(diào)節(jié)免疫功能［9］等作用。目前對苦參的研究多集中在苦參化學(xué)成分和生物活性等方面，但是對苦參基因組信息方面的研究尚未涉及。

基因組蘊含了生物體的遺傳信息，基因組大小具有物種穩(wěn)定性，是基因組研究的基本內(nèi)容?；蚪M大小就是指生物單倍體基因組所含的DNA 總量，又稱C 值。本研究通過對苦參進行流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM） 的分析，測定其基因組大小，以期有助于確定適合苦參屬植物全基因組測序的研究策略。

1 材料與方法

1.1 樣品 苦參種子由山西中醫(yī)藥大學(xué)山西道地藥材種子資源庫提供（種子采自山西省臨汾市曲沃縣）；實驗用的對照植株是大豆品種William 82，其種子由中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所孔凡江教授惠贈。將苦參種子、William 82 種子分別種植于實驗室花盆中，出苗后分別摘取苦參、William 82 的新鮮葉子作為實驗材料。

1.2 材料 MgCl2·6H2O（批號D503BA0042）、MOPS（批號CB23BA0020），均購于BBI 生命科學(xué)有限公司；檸檬酸鈉（批號 D223BA0020）、Triton X-100（批號D220BA0041），均購于生工生物工程股份有限公司；400目尼龍篩網(wǎng)（批號20161111）、PI（批號326C0428）、RNase（批號20170607），均購于北京索萊寶科技有限公司。

1.3 FCM 測定苦參基因組大小方法建立

1.3.1 細(xì)胞核懸液制備 摘取苦參新鮮嫩葉3 份，每份稱定質(zhì)量20 mg，用蒸餾水沖洗掉葉片表面塵土，再漂洗2 次，濾紙擦拭干葉片后放入預(yù)冷的培養(yǎng)皿中，加入1 mL 4℃保存?zhèn)溆玫腉albraith's 裂解液［10］（45 mmol／L MgCl2·6H2O，30 mmol／L檸檬酸鈉，20 mmol／L MOPS，0.1% Triton X-100，pH＝7.0），用鋒利的單刃刀片垂直快速將葉片切碎（注意葉片必須浸在裂解液里），培養(yǎng)皿置于冰上5 min，用移液器吸取培養(yǎng)皿內(nèi)液體，經(jīng)400目尼龍網(wǎng)過濾得到細(xì)胞核懸液。同樣方法分別制備William 82 的細(xì)胞核懸液、William 82 與苦參等質(zhì)量葉片混合的細(xì)胞核懸液。向細(xì)胞核懸液內(nèi)依次加入20 μL 1 mg／L RNase 和20 μL 1 mg／L PI熒光染料，用移液器輕輕吹打溶液使其混勻、并使團狀的細(xì)胞核分開，4℃低溫避光染色5 min。

1.3.2 FCM 檢測與數(shù)據(jù)處理 將各樣本移至流式細(xì)胞儀的上樣管，各管依次經(jīng)FACSCalibur 流式細(xì)胞儀檢測。采用488 nm 波長的光激發(fā)PI，在FL2 通道收集PI 的發(fā)射熒光強度，依次檢測William 82、苦參、William 82 和苦參混合樣本，低速收集5 000個細(xì)胞核（含碎片），各做3 次平行測定。圖像和數(shù)據(jù)用流式細(xì)胞儀自帶軟件進行分析。變異系數(shù)CV 在5% 以內(nèi)，則數(shù)據(jù)分析出的C 值結(jié)果可信［11］?？鄥⒒蚪M大小的計算公式為苦參的基因組大?。娇鄥⒎宓臒晒鈴姸染担疻illiam 82 峰的熒光強度均值×William 82的基因組大小［12］。

2 結(jié)果與分析

先對大豆William 82、苦參進行單獨檢測，比較苦參與William 82 的圖譜，圖1 可見出現(xiàn)峰的通道數(shù)值不同，提示苦參與William 82 測定峰無重疊，保證了William 82 作為內(nèi)參的可靠性，可用于分析苦參基因組的大小，見圖1A～1B。以William 82 為內(nèi)標(biāo)檢測苦參基因組的大小見圖1C，混合后的測定確實無重疊，區(qū)分度良好。表1 數(shù)據(jù)顯示，CV 均在5%以內(nèi)，苦參峰的熒光均值為457.93，William 82峰的熒光均值為215.45，苦參的基因組大小具體為William 82 的2.13 倍，William 82 的基因組大小為1.11 Gb［13］，由此分析出苦參的基因組大小為2.36 Gb。

圖1 各樣品流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

3 討論

流式細(xì)胞術(shù)是一種可以研究細(xì)胞、微生物、DNA、蛋白質(zhì)或者其他分子的技術(shù)，這些顆粒需要帶有熒光素的特異抗體或用染料進行染色才能被檢測到。隨著流式細(xì)胞儀的不斷創(chuàng)新，以及新型熒光染料的不斷開發(fā)和應(yīng)用，流式細(xì)胞術(shù)逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域強有力的研究工具，并被認(rèn)為是生物學(xué)歷史上最偉大的發(fā)明之一。在植物學(xué)的研究領(lǐng)域中，流式細(xì)胞術(shù)主要用于植物細(xì)胞核基因組大小的檢測以及染色體倍性的鑒定。

表1 苦參基因組大小測定結(jié)果

盡管流式細(xì)胞術(shù)測定植物基因組大小的技術(shù)日益進步，但由于影響測定結(jié)果的因素較多，所以在某種程度上限制了植物基因組大小的研究，其中藥用植物基因組大小的研究更是處于起步階段，只有為數(shù)不多的藥用植物的基因組大小被測定，有鐵皮石斛［14］、丹 參［15］、人 參［16］、三七［17］、茅蒼術(shù)［18］、鬼針草［19］、黃芩［20］等。在眾多的影響因素中，裂解液的選擇十分關(guān)鍵。市面上很少見到流式細(xì)胞儀公司開發(fā)的可用于流式細(xì)胞術(shù)測定植物基因組大小的裂解液，因為到目前為止仍然沒有一種通用的提取植物細(xì)胞核的裂解液。不同種屬的植物可能選用不同的裂解液；還有可能由于同一植物的部位不同，其中所包含的多酚、多糖等代謝產(chǎn)物的不同而對分析結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響，致使同一種植物的不同部位也需要選擇不同的裂解液。本研究提取苦參嫩葉的細(xì)胞核先用物理方法切碎，但是切碎不能獲得大量完整的細(xì)胞核，必須再加入Galbraith's 裂解液，其包括Triton X-100、MgCl2、檸檬酸鈉、MOPS 等成分。Triton X-100 作為一種非離子型表面活性劑，可以促進細(xì)胞核的釋放、有助于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體的離散、并有效減少細(xì)胞核的粘連；檸檬酸鈉作為金屬離子螯合劑，可與核酸酶輔助因子的二價金屬陽離子結(jié)合，進而抑制核酸酶的活性，避免基因組DNA 的降解；Mg2＋和MOPS 均發(fā)揮穩(wěn)定溶液pH 值的作用。合適的裂解液不僅有助于成功提出植物的細(xì)胞核懸液，也有助于減少碎片并降低變異系數(shù)。本實驗用Galbraith's 裂解液提取苦參細(xì)胞核懸液，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測所獲實驗數(shù)據(jù)的變異系數(shù)均在5% 以內(nèi)，表明Galbraith's 裂解液適合用于苦參基因組大小的測定。在此基礎(chǔ)上，課題組進一步檢測分析出苦參基因組大小為2.36 Gb。

基因組的大小是植物的基本屬性，也是研究植物的基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)，技術(shù)性原因使這方面的研究目前較少。而本研究建立流式細(xì)胞術(shù)測定苦參基因組大小的方法，以期為同屬或同科植物測定其基因組大小提供技術(shù)性參考，有助于提高相應(yīng)實驗研究的成功率；為后續(xù)破譯苦參基因組的方案選擇奠定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。