張 超 姚成增 蔣梅先* 關(guān)敬樹

（1.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心內(nèi)科， 上海201999； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院心內(nèi)科， 上海200021）

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，活心方加載治療冠心病心絞痛有確切的臨床療效，并能提高患者的左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），改善血流動力學(xué)指標(biāo)，縮小急性心梗大鼠的梗死面積，從而改善心梗后大鼠的心功能［1-2］。本文目的是通過結(jié)扎冠狀動脈前降支的方法構(gòu)建雄性SD 大鼠急性心梗模型，觀察活心方干預(yù)對心梗模型鼠梗死邊緣區(qū)缺血心肌血管密度及其陽性面積比值、血管新生相關(guān)因子及其受體表達(dá)以及血清血管內(nèi)皮生長因子（VEGF） 表達(dá)等的影響，進(jìn)一步重點(diǎn)探明活心方治療冠心病的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 雄性SD 大鼠107 只，體質(zhì)量200～250 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（滬） 2003-0002。

1.2 藥物 血竭小復(fù)方由血竭、降香、三七等3 味藥按1∶1∶2的比例共研末，加入到由生理鹽水及羧甲基纖維素鈉配制的0.5%羧甲基纖維素鈉混懸劑中，制成含生藥量為0.016 2 g／mL 的血竭小復(fù)方混懸劑。活心方含黃芪、桂枝、象貝母、血竭等9 味中藥，其中血竭等3 味藥研末后制成含生藥量為0.032 4 g／mL 血竭小復(fù)方混懸劑，其余黃芪等制成含生藥量為1.656 g／mL 的水煎劑；將上述2 制劑等體積混合，最終配制成含生藥量為0.844 g／mL 的活心方水劑。上述藥物由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院藥劑科制備提供，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。貝?fù)濟(jì)（珠海億勝生物制藥有限公司，批號20070106）；肝素鈉注射液（上海市第一生化藥業(yè)有限公司，批號060601）。

1.3 試劑 CD34 免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，BA0532）；VEGF ELISA 試劑盒（上海奇康生物科技有限公司，RRV00）；VEGF 免疫組化試劑盒（美國Santa Cruz 公司，Sc-7269）；bFGF 免疫組化試劑盒（美國Chemicon 公司，AB1458）；Flt-1 免疫組化試劑盒（美國Lab Vision 公司，Rb-9049-p1）；Flk-1 免疫組化試劑盒（美國Santa Cruz 公司，Sc-6251）。

1.4 儀器 DW2000型小動物呼吸機(jī)（上海嘉鵬科技有限公司）；OLYMPUS BX60 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；MIQS 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)、醫(yī)學(xué)圖像分析軟件（上海求為生物科技有限公司）；OLYMPUS BH2 顯微鏡（日本Olympus公司）；LKB V型超薄切片機(jī)（瑞典LKB 公司）；NIKON 4500 數(shù)碼相機(jī)（日本Nikon 公司）；DYNEX OPSYS MR 酶標(biāo)儀（美國Dynex 公司）。

2 方法

2.1 造模及分組 大鼠實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、貝復(fù)濟(jì)組、血竭小復(fù)方組和活心方組。除假手術(shù)組大鼠外，其余大鼠均參照相關(guān)文獻(xiàn)［3-4］，用鹽酸氯胺酮（80 mg／kg） 腹腔麻醉，氣管插管后接人工呼吸機(jī)輔助呼吸（呼吸頻率為90 次／分，潮氣量為4～6 mL）。術(shù)前75%酒精消毒后，在左胸第4～5 肋骨間作橫切口，從左側(cè)第4 肋間鈍性分離打開胸腔，輕輕擠壓胸腔，暴露心臟，剪開心包，在肺動脈圓錐與左心耳交界稍下1～2 mm處用無創(chuàng)性縫線結(jié)扎左側(cè)冠狀動脈前降支，開胸前后即時記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。以結(jié)扎部位以下心肌變白且搏動減弱，并且心電圖出現(xiàn)ST 段弓背向上明顯抬高為造模成功，然后逐層縫合胸壁，待其恢復(fù)自主呼吸，拔除插管。造模當(dāng)天始每天注射青霉素3 d 預(yù)防感染。假手術(shù)組在開胸后不結(jié)扎左冠狀動脈前降支，而僅在相應(yīng)部位用無線縫針空穿1次即縫合胸壁，其余步驟與模型動物處理相同。

2.2 給藥 參照相關(guān)文獻(xiàn)［5］，根據(jù)“人和動物按體表面積折算的等效劑量比值表” 折算給藥劑量。血竭小復(fù)方組及活心方組大鼠在心梗造模后第2 天開始藥物干預(yù)，分別給予血竭小復(fù)方混懸液（生藥量0.162 g／kg） 和活心方水劑（生藥量8.44 g／kg），1 次／d，灌胃給藥8 周。貝復(fù)濟(jì)組大鼠于開胸結(jié)扎冠脈后立即在結(jié)扎處周圍予貝復(fù)濟(jì)噴灑3 次（125 IU／次），術(shù)后開始每日皮下注射肝素1 次（1 250 U／kg），共5 d；在心梗造模后第2 天開始每天用等體積生理鹽水灌胃，共8 周。假手術(shù)組及模型組大鼠在造模后第2 天開始每天用等體積生理鹽水灌胃，共8 周。

2.3 取材 干預(yù)8 周后，各組大鼠右心房取血5 mL 后，立即用生理鹽水右心房灌注，10%福爾馬林溶液固定心臟，剪去主動脈弓、右心室、心房、心耳等，在左心室乳頭肌水平橫切面切取心肌組織（包括梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)、健存區(qū)），10%福爾馬林液中保存，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片，待作梗死邊緣區(qū)心肌血管密度及其陽性面積比值、血管新生相關(guān)因子及其受體的表達(dá)等指標(biāo)檢測。

2.4 觀察指標(biāo)與檢測方法

2.4.1 缺血心肌血管密度（MVD） 及其陽性面積比值檢測 ①心肌組織CD34 免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP） 法染色梗死邊緣區(qū)心肌組織切片，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性反應(yīng)。經(jīng)MIQS 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)處理，計算梗死邊緣區(qū)顯示有CD34 陽性染色的血管數(shù)目，每張切片隨機(jī)觀察3個視野（×250），取均數(shù)，再根據(jù)測量窗面積（0.034 mm2） 即可算出每平方毫米的血管數(shù)目即心肌血管密度；并測定陽性區(qū)域面積，計算血管陽性面積比值＝（SP 染色陽性區(qū)域面積／測窗面積） ×100%。②取免疫組化染色切片，通過顯微鏡、圖像采集卡、數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行圖像采集，格式為標(biāo)準(zhǔn)的位圖（BMP）文件格式；物鏡倍數(shù)為250 倍，電壓為3.05 V，電流為2.72 A；測量距離采用顯微鏡專用校正微尺進(jìn)行標(biāo)定（計算機(jī)自動計算得到比例因子后存儲備用）；采用軟件去除圖像中的紫藍(lán)色背景，用鼠標(biāo)先后選擇陰性區(qū)域（處理后該區(qū)域用藍(lán)色表示） 和棕黃色或棕褐色的陽性區(qū)域（處理后該區(qū)域用紅色表示）；測量方式采用全視場測量，測量結(jié)果取陽性區(qū)域面積的平均值。

2.4.2 血管新生相關(guān)因子及其受體檢測 ①血清VEGF水平測定。在2%戊巴比妥鈉麻醉下，右心房所取血5 mL，以3 000 r／min 離心10 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 測定大鼠血清VEGF 水平。②心肌VEGF、bFGF、Flt-1 及Flk-1 表達(dá)測定。采用免疫組織化SP 法染色梗死邊緣區(qū)心肌組織切片，檢測VEGF、bFGF、血管內(nèi)皮生長因子受體1（Flt-1） 及血管內(nèi)皮生長因子受體2（Flk-1）的表達(dá)。以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性反應(yīng)。應(yīng)用MIQS 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計算缺血心肌每個視野（×250） 中的陽性區(qū)域面積和光密度值，隨機(jī)測定3個視野，取其均值作為樣本的測定值，計算心肌血管新生相關(guān)因子及受體的免疫組化陽性指數(shù)（陽性面積×光密度值）。③取免疫組化染色切片，通過顯微鏡、圖像采集卡、數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行圖像采集，格式為標(biāo)準(zhǔn)的位圖（BMP） 文件格式；物鏡倍數(shù)為250 倍，電壓為3.33 V，電流為2.00 A；測量距離采用顯微鏡專用校正微尺進(jìn)行標(biāo)定（計算機(jī)自動計算得到比例因子后存儲備用）；采用軟件去除圖像中的紫藍(lán)色背景，用鼠標(biāo)先后選擇陰性區(qū)域（處理后該區(qū)域用藍(lán)色表示） 和棕黃色或棕褐色的陽性區(qū)域（處理后該區(qū)域用紅色表示）；測量方式采用全視場測量，測量結(jié)果取陽性區(qū)域面積和陽性比率以及光密度值的平均值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0 版本軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，指標(biāo)檢測結(jié)果以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用LSD 法，方差不齊時采用Dunnett's T3 法。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

實驗共用去雄性SD 大鼠107 只，其中假手術(shù)組12 只，造模95 只，造模后存活48 只，隨機(jī)分為模型組、貝復(fù)濟(jì)組、血竭小復(fù)方組和活心方組，每組12 只；故60 只大鼠進(jìn)入后續(xù)實驗。最終各組分別成功獲取大鼠血清標(biāo)本11份，并對各組先入組的8 只大鼠留取了心肌組織標(biāo)本。

3.1 各實驗組大鼠缺血心肌血管密度及其陽性面積比值比較 ①心肌血管密度，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠缺血心肌血管密度增加（P＜0.05）；與模型組大鼠相比，貝復(fù)濟(jì)組、血竭小復(fù)方組（P＜0.05） 及活心方組（P＜0.01）大鼠心肌血管密度增加；各用藥組間比較顯示，活心 方組較貝復(fù)濟(jì)組（P＜0.01） 及血竭小復(fù)方組（P＜0.05）心肌血管密度增加。②心肌血管陽性面積比值，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠心肌血管陽性面積比值有增大的趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組大鼠相比，貝復(fù)濟(jì)組、血竭小復(fù)方組（P＜0.05） 及活心方組（P＜0.01）大鼠心肌血管陽性面積比值均增大；各用藥組間比較，活心方組較貝復(fù)濟(jì)組心肌血管陽性面積比值增大（P＜0.05），兩中藥組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 活心方對心肌梗死大鼠心肌血管密度及其陽性面積比值的影響（， n＝8）

表1 活心方對心肌梗死大鼠心肌血管密度及其陽性面積比值的影響（， n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與貝復(fù)濟(jì)組比較，ΔP ＜0.05，ΔΔ P ＜0.01；與血竭小復(fù)方組比較，▲P＜0.05。

3.2 各實驗組大鼠血清VEGF 水平比較 與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠血清VEGF 水平升高（P＜0.05）；與模型組大鼠相比，活心方組大鼠血清VEGF 水平升高（P＜0.01），其他兩用藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；各用藥組間比較，活心方組較貝復(fù)濟(jì)組血清 VEGF 水平升高（P＜0.05），兩中藥組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 活心方對心肌梗死大鼠血清VEGF 水平的影響（，n＝11）

表2 活心方對心肌梗死大鼠血清VEGF 水平的影響（，n＝11）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與貝復(fù)濟(jì)組比較，ΔP＜0.05。

3.3 各實驗組大鼠缺血心肌VEGF、bFGF、Flt-1 及Flk-1表達(dá)比較 免疫組化結(jié)果顯示，①與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠心肌VEGF（P＜0.05）、bFGF、Flt-1 及Flk-1（P＜0.01） 表達(dá)均增加；②與模型組大鼠相比，各用藥組大鼠心肌VEGF、bFGF 表達(dá)均增加（P＜0.01），貝復(fù)濟(jì)組（P＜0.05） 及活心方組、血竭小復(fù)方組（P＜0.01） 大鼠心肌Flt-1 表達(dá)增加，活心方組大鼠心肌Flk-1 表達(dá)增加（P＜0.01）。③各用藥組間比較，活心方組心肌VEGF 表達(dá)較貝復(fù)濟(jì)組（P＜0.01） 及血竭小復(fù)方組（P＜0.05） 增加，活心方組心肌bFGF 表達(dá)較貝復(fù)濟(jì)組及血竭小復(fù)方組均增加（P＜0.01），活心方組大鼠心肌Flk-1 表達(dá)較貝復(fù)濟(jì)組及血竭小復(fù)方組大鼠增加（P＜0.05）。見表3。

4 討論

現(xiàn)今對于冠心病的治療中，冠狀動脈血運(yùn)重建使許多患者的臨床癥狀得以改善，高?；颊叩纳媛实玫教岣摺５?，一些冠狀動脈彌漫性病變的患者卻因種種原因而無法進(jìn)行血運(yùn)重建治療，部分患者則面臨術(shù)后再狹窄或晚期血栓等諸多問題。治療性血管新生成為一種潛在的替代療法，即通過刺激缺血心肌小血管生長和側(cè)支循環(huán)的形成，實現(xiàn)心肌缺血區(qū)的自我搭橋，這無論對急性心肌梗死患者還是對相當(dāng)數(shù)量的彌漫性冠脈病變、無條件接受傳統(tǒng)血運(yùn)重建治療的患者來說，都是一種極具吸引力和有前途的治療模式［6-7］。本研究通過結(jié)扎冠狀動脈前降支的方法構(gòu)建大鼠急性心梗模型，觀察活心方干預(yù)對梗死邊緣區(qū)缺血心肌血管新生等的影響。已知，貝復(fù)濟(jì)能促進(jìn)血管新生，可增加側(cè)支循環(huán)的建立，肝素能提高其活力［8-9］，故將貝復(fù)濟(jì)選作本研究的陽性對照藥物。

表3 活心方對心肌梗死大鼠心肌VEGF、bFGF、Flt-1 及Flk-1 表達(dá)的影響（， n＝8）

表3 活心方對心肌梗死大鼠心肌VEGF、bFGF、Flt-1 及Flk-1 表達(dá)的影響（， n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與貝復(fù)濟(jì)組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與血竭小復(fù)方組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

4.1 活心方對缺血心肌血管密度及其陽性面積比值的影響 正常成年大鼠很少見到心肌毛細(xì)血管的生長，但當(dāng)心肌缺血缺氧時，冠脈新生血管形成，側(cè)支循環(huán)建立，以提高心肌組織灌注，保證缺血心肌血供，維持心臟功能。本研究觀察到模型組大鼠心肌血管密度較假手術(shù)組增加，提示心梗大鼠存在缺血心肌血管新生。心肌血管密度及其陽性面積比值均能較客觀地反映缺血心肌中毛細(xì)血管的數(shù)量和面積，是缺血心肌血管新生情況直接、可靠的觀察指標(biāo)［10］。CD34 在早期和成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，是一種強(qiáng)大的泛內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物［11］，故本研究通過檢測缺血心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34 表達(dá)情況，計算心肌血管密度及其陽性面積比值，以反映大鼠缺血心肌血管新生情況。

本研究結(jié)果顯示，活心方及血竭小復(fù)方干預(yù)均能不同程度地提高模型鼠缺血心肌血管密度及其陽性面積比值，且以活心方的作用優(yōu)于貝復(fù)濟(jì)，提示活心方和血竭小復(fù)方均能促進(jìn)缺血心肌血管新生，改善心肌血流灌注；進(jìn)一步拆方研究發(fā)現(xiàn)，在增加缺血心肌血管密度方面，活心方較血竭小復(fù)方作用更為顯著。

4.2 活心方對心梗大鼠血清、心肌VEGF 水平及其受體和bFGF 表達(dá)的影響 心肌缺血缺氧是引起心肌血管新生的主要因素，該過程中涉及到諸多細(xì)胞生長因子，其中以VEGF 和bFGF 最為重要，起著核心作用。VEGF 為內(nèi)皮細(xì)胞特異性的促有絲分裂因子，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，并抑制其凋亡，在調(diào)節(jié)血管和淋巴管新生中起重要作用。通過作用于相應(yīng)的受體，VEGF 高度特異地誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，直接刺激血管生成；此外，VEGF可使微血管的通透性增加，導(dǎo)致血漿蛋白等漏出，進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)，纖維蛋白成分在血管外凝結(jié)，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及新血管形成提供基質(zhì)支架［12-13］。目前已知VEGF 有3 種特異性絡(luò)氨酸激酶受體：Flt-1、Flk-1 及Flt-4。其中Flt-1、Flk-1 表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞（Flt-4 表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞），故VEGF 通過作用于Flt-1 及Flk-1 而發(fā)揮促血管新生作用，而Flk-1 更是VEGF 促有絲分裂、促血管新生和滲透性改變的主要受體，對VEGF 生物活性的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用［14-15］。bFGF 是強(qiáng)效內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，bFGF 和VEGF 在促進(jìn)血管新生中存在著明顯的協(xié)同作用，對促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、促蛋白激酶釋放以降解基底膜及促內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔等起著重要作用［16］。

本研究觀察到模型組大鼠存在缺血心肌VEGF、bFGF、Flt-1 及Flk-1 表達(dá)增加及血清VEGF 水平升高，提示心梗后大鼠由于心肌缺血缺氧，導(dǎo)致血管新生相關(guān)因子及其受體表達(dá)增加，從而促進(jìn)缺血心肌血管新生?；钚姆礁深A(yù)可使模型鼠缺血心肌VEGF、bFGF、Flk-1 表達(dá)增加及血清VEGF 水平升高，且優(yōu)于貝復(fù)濟(jì)及血竭小復(fù)方；對心肌Flt-1 表達(dá)的影響在三種干預(yù)藥物顯示了類似的作用，而兩中藥組顯示了更好的趨勢。結(jié)果說明本研究干預(yù)藥物可能通過促進(jìn)缺血心肌VEGF、bFGF、Flt-1 及Flk-1 的表達(dá)，并提高血清VEGF 水平，促進(jìn)缺血心肌的血管新生，以恢復(fù)缺血心肌血液供應(yīng)，拯救瀕臨凋亡的心肌細(xì)胞，從而減少梗死面積，改善心功能。其中以活心方作用更為顯著。

冠心病心絞痛屬于祖國醫(yī)學(xué)之“胸痹” 范疇，其病機(jī)屬本虛標(biāo)實，本虛為陰陽氣血的虧虛，以氣虛陽虛者為多見；標(biāo)實為痰濁、血瘀、寒凝、氣滯交互為患?；钚姆綖槿珖嗅t(yī)嚴(yán)世蕓教授治療冠心病心絞痛的經(jīng)驗方，該方以生黃芪、桂枝、象貝母等益氣通陽、化痰軟堅，三七、血竭、降香等活血化瘀止痛，用以治療冠心病心絞痛有著良好的臨床療效。本研究證實了活心方干預(yù)急性心梗大鼠能顯著提高其梗死邊緣區(qū)缺血心肌血管密度及其陽性面積比值，其藥效作用可能與增加缺血心肌VEGF 及其受體和bFGF 表達(dá)，并升高血清VEGF 水平有關(guān)。研究結(jié)果顯示兼有益氣活血、化痰軟堅功效的活心方較單純活血化瘀的血竭小復(fù)方有著更強(qiáng)的促血管新生作用，表明益氣活血、化痰軟堅的治則更符合冠心病本虛標(biāo)實病機(jī)，可以帶來更好的臨床療效。