肖美芳 陸 喆 陳柳英 陳 芬

（海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心， 海南 ?？?70206）

宮頸癌是常見的惡性腫瘤，在全球女性中其發(fā)病率僅次于乳腺癌，居于第2 位，對(duì)婦女的健康有著重要的影響［1］。近年來，宮頸癌的發(fā)病機(jī)理及治療手段受到了廣泛的關(guān)注，2016 年世界衛(wèi)生組織公布，全球每年宮頸癌新發(fā)病例超過47 萬。宮頸癌的死亡率較高，在中國(guó)每年新發(fā)病例超過13 萬，其中死亡約5.3 萬，且死亡率仍呈上升趨勢(shì)［2］。木犀草素（Luteotin） 是一種天然的黃酮類化合物，具有多種藥理作用，如抗炎、抗氧化和抗癌［3-4］。本研究探討了木犀草素對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞的增殖和凋亡的作用，以及其相關(guān)信號(hào)通路。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 Hela 細(xì)胞株購(gòu)于普如汀生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 藥物與試劑木犀草素（純度為98%，批號(hào)20180112） 購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)公司；DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)64017510）、胎牛血清（批號(hào)1616626） 購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)SHBB5 172 V） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；AG490（批號(hào)20170524）、MTT（批號(hào)20180121） 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；JAK2 抗體（貨號(hào)ab108596，批號(hào)GR171114-1）、p-JAK2 抗 體（貨 號(hào)ab32101，批號(hào) GR171514-2 ）、STAT3 抗 體（貨 號(hào)ab119352，批號(hào) GR171514-2）、p-STAT3 抗 體（貨 號(hào)ab76315，批號(hào)GR161326-2）、BAX 抗體（貨號(hào)ab32503，批號(hào)GR88385-2）、BCL-2 抗 體（貨 號(hào)ab185002，批號(hào)GR161516-2），辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H ＋L）（貨號(hào)ab205718，批號(hào)GR84261-1） 均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 儀器 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDoc MP，美國(guó)Bio-Rad 公司）；水平搖床（WD-9405B，北京六一儀器有限公司）；轉(zhuǎn)移槽（DYCZ-40D，北京六一儀器有限公司）；雙垂直蛋白電泳儀（DYCZ-24DN，北京六一儀器有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（HF-90，上海力申科學(xué)儀器有限公）；酶標(biāo)儀（ELX-800，美國(guó)Bio-Tek 公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌Hela 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% 胎牛血清和1% 鏈霉素和青霉素雙抗液DMEM 培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 天用胰酶消化，進(jìn)行傳代。

2.2 藥物處理 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela 細(xì)胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入10、20、30、40 μmol／L 木犀草素或DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，分組為對(duì)照組、木犀草素10 μmol／L組、木犀草素20 μmol／L組、木犀草素30 μmol／L組、木犀草素40 μmol／L組。根據(jù)木犀草素對(duì)Hela 細(xì)胞增殖和凋亡影響的結(jié)果，選擇最適木犀草素濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。選用JAK2 抑制劑AG490（40 μmol／L）處理Hela 細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 Western blot 檢測(cè) 收集各組Hela 細(xì)胞于離心管中，加入RIPA 裂解液，電動(dòng)勻漿器進(jìn)行裂解，BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。上樣量為20 μg 蛋白質(zhì)，通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，用PBS 清洗PVDF 膜5 min，加入5%脫脂奶粉封閉1 h。加入JAK2抗體（1∶2 000）、p-JAK2 抗體（1∶2 500）、STAT3 抗體（1∶2 000）、p-STAT3 抗體（1∶2 500）、Bax 抗體（1∶2 000）、Bcl-2 抗體（1∶2 000），4℃孵育過夜。加入二抗（1∶2 500），37℃孵育1 h。二抗孵育后使用ECL 發(fā)光液處理，在暗室中進(jìn)行曝光拍照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.4 MTT 檢測(cè) 96 孔板每孔加入合適數(shù)量的細(xì)胞，藥物處理24 h，將藥物處理后的各組細(xì)胞的培養(yǎng)液移除并用PBS 清洗3 次。各組細(xì)胞中添加5 mg／mL MTT，并在37℃培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，移除培養(yǎng)液，加入200 μL DMSO 溶液來溶解沉淀。酶標(biāo)儀測(cè)定各組Hela 細(xì)胞在490 nm 處OD。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5 次。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將藥物處理后的各組Hela細(xì)胞充分消化，PBS 清洗，收集至流式管。利用Binding Buffer（500 μL） 重懸細(xì)胞，并加入Annexin V-FITC（5 μL）輕輕混勻，隨后加入Propidium Iodide（10 μL） 染料處理細(xì)胞，室溫條件下避光孵育15 min。細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用Graphpad Prism 6 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及數(shù)據(jù)作圖。數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用方差分析。以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 木犀草素對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖的影響 MTT 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，木犀草素（30、40 μmol／L） 處理24 h 后可抑制Hela 細(xì)胞的增殖（P＜0.01），呈劑量依賴性；且40 μmol／L木犀草素處理Hela 細(xì)胞的存活率最低，見圖1。

圖1 不同濃度木犀草素對(duì)Hela 細(xì)胞增殖的影響

3.2 木犀草素對(duì)Hela 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組Hela 細(xì)胞凋亡率是4.2%，10、20、30、40 μmol／L 木犀草素處理24 h 后，Hela 細(xì)胞凋亡率分別是5.9%、11.5%、18.7%、24%；與對(duì)照組比較，木犀草素（30、40 μmol／L） 可以促進(jìn)Hela 細(xì)胞凋亡（P＜0.01），見圖2。結(jié)合40 μmol／L 木犀草素對(duì)Hela 細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，選擇40 μmol／L 木犀草素處理細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.3 木犀草素抑制Hela 細(xì)胞JAK2、STAT3 磷酸化激活 Western blot 結(jié)果顯示，40 μmol／L 木犀草素處理24 h后，Hela 細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)降低；JAK2 抑制劑AG490（40 μmol／L） 處理24 h 后，Hela 細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)也降低；當(dāng)木犀草素與AG490 共同處理Hela 細(xì)胞后，p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)更低，見圖3。提示，在Hela 細(xì)胞中，木犀草素可抑制JAK2、STAT3 磷酸化激活。

3.4 木犀草素通過JAK2／STAT3 信號(hào)通路調(diào)控Hela 細(xì)胞的增殖和凋亡 經(jīng)40 μmol／L 木犀草素、JAK2 抑制劑AG490處理Hela 細(xì)胞24 h 后，Hela 細(xì)胞增殖受到抑制（P＜0.01），Bax 蛋白表達(dá)增加，Bcl-2 蛋白表達(dá)下降；當(dāng)木犀草素與AG490 共同處理Hela 細(xì)胞后，Hela 細(xì)胞增殖抑制作用更強(qiáng)，Bax 蛋白表達(dá)更高，Bcl-2 蛋白表達(dá)更低。見圖4。

4 討論

宮頸癌是全球第二常見的女性癌癥，每年導(dǎo)致260 000位女性死亡［5］。近年來，對(duì)宮頸癌的病因、治療手段的研究已成為熱點(diǎn)。侵襲轉(zhuǎn)移是宮頸癌治療過程中難以攻克的問題之一。

圖3 木犀草素對(duì)Hela 細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3 表達(dá)的影響

目前，黃酮類化合物治療宮頸癌細(xì)胞侵襲已有部分研究［6-7］，但其內(nèi)在機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。木犀草素作為黃酮類化合物家族中的一員，廣泛存在于各種水果和蔬菜中，已被證實(shí)有多種藥理功能，包括抗氧化、抗惡性細(xì)胞增殖［8-10］。研究［6］表明，木犀草素可以通過逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT） 信號(hào)，抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力。木犀草素可與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL） 協(xié)同作用，促進(jìn)宮頸癌Hela 細(xì)胞凋亡［11］。盡管如此，木犀草素在治療宮頸癌中的作用和機(jī)制尚未完全明確。劉鑫鑫等［12］研究表明木犀草素對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞的增殖具有抑制作用，細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)出明顯的凋亡形態(tài)，但具體機(jī)制并未進(jìn)行深入研究。

STAT3 作為JAK／STAT 信號(hào)通路中重要的信號(hào)分子，具有介導(dǎo)多種細(xì)胞因子的作用，在腫瘤組織和細(xì)胞中其呈高水平激活狀態(tài)，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡等過程具有關(guān)鍵的調(diào)控作用［13］。有研究［14］表明，木犀草素在多種癌細(xì)胞中通過激活JAK1／STAT1／2 信號(hào)通路來調(diào)控干擾素α／β 發(fā)揮抗腫瘤增殖作用。然而，多個(gè)研究表明木犀草素可以抑制STAT3 的信號(hào)激活調(diào)控多種癌細(xì)胞的增殖和凋亡，如胰腺癌細(xì)胞［15］、胃癌細(xì)胞［16］、肺腺癌［17］等。目前，已有多個(gè)研究表明，宮頸癌的治療過程中，抑制STAT3 信號(hào)通路，有效抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡［18］。目前，木犀草素在宮頸癌細(xì)胞中的調(diào)控是否通過JAK2／STAT3 信號(hào)通路尚未有研究。

在本研究中，探究了木犀草素對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞的增殖能力及凋亡的影響及其潛在作用機(jī)制。木犀草素處理Hela 細(xì)胞24 h，木犀草素顯著抑制Hela 細(xì)胞的增殖，與劉鑫鑫等［12］研究結(jié)果一致，同時(shí)證明木犀草素顯著促進(jìn)Hela細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)劑量依賴 性。本實(shí)驗(yàn)中，p-JAK2、p-STAT3在Hela 細(xì)胞中呈高表達(dá)，JAK2 特異性抑制劑AG490 顯著抑制p-JAK2、p-STAT3 的表達(dá)，且AG490 處理可以抑制Hela 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)Hela 細(xì)胞的凋亡，說明Hela 細(xì)胞的增殖及凋亡受JAK2／STAT3 信號(hào)通路的調(diào)控。對(duì)比AG490 處理組，木犀草素與AG490 共同處理Hela 細(xì)胞，對(duì)Hela 細(xì)胞增殖能力及凋亡調(diào)控更加顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明木犀草素在宮頸癌Hela 細(xì)胞中抑制JAK2／STAT3 信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控Hela 細(xì)胞的增殖及凋亡。

圖4 木犀草素通過JAK2／STAT3 信號(hào)通路調(diào)控Hela 細(xì)胞的增殖和凋亡

綜上所述，本研究證明了木犀草素通過調(diào)控JAK2／STAT3 信號(hào)通路的激活，抑制宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖，促進(jìn)宮頸癌Hela 細(xì)胞凋亡。