吳淼林 羅穎穎 嚴(yán) 新 陳蘭英 崔亞茹 劉 鵬 謝欣序 余 軍

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心， 江西 南昌330004； 2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 國(guó)家工程研究中心， 江西南昌330004； 3.江西中醫(yī)藥大學(xué) 第二附屬醫(yī)院， 江西 南昌330012）

炎癥是機(jī)體應(yīng)對(duì)刺激做出的防御反應(yīng)，適度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用，而持續(xù)存在、無法消退的炎癥可誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起到重要作用［1］，其被稱為惡性腫瘤的第七大生物學(xué)特征［2］。大量流行病學(xué)資料表明，炎癥與腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，如幽門螺桿菌的感染使得胃癌發(fā)生的幾率上升［3］；慢性乙肝、丙肝以及肝吸蟲感染使患者患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)增加［4］。炎性細(xì)胞的長(zhǎng)期浸潤(rùn)可介導(dǎo)正常上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，同時(shí)，不同的炎癥因子的分泌，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管發(fā)生及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，使腫瘤成為“永不愈合的創(chuàng)傷”。

中醫(yī)藥在提高機(jī)體免疫力，治療腫瘤，減少副作用方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，是潛在的腫瘤治療方法。白頭翁Pulsatilla chinensis（Bunge） Regel.始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性寒、味苦，具有清熱解毒、燥濕殺蟲、涼血止痢的功效，還具有抗炎、抗寄生蟲、抗菌等功能［5］。白頭翁主要活性成分——白頭翁皂苷，具有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤等作用，其能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖［6-7］以及擾亂腫瘤能量代謝［8］等方式抑制腫瘤的發(fā)展。但白頭翁皂苷對(duì)荷瘤小鼠相關(guān)炎癥的影響尚未見報(bào)道。本研究擬采用B16-F10 荷瘤小鼠模型，觀察白頭翁皂苷抑制腫瘤發(fā)展的作用及對(duì)包括炎癥因子在內(nèi)的細(xì)胞因子（IL-6、TNF-α、IFN-γ 等） 的影響，探討白頭翁皂苷影響炎癥因子與抑制黑色素瘤的作用間的潛在機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞 SPF 級(jí)C57BL／6 小鼠43 只，雄性，4～5周齡，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘） 2016-0002；黑色素瘤細(xì)胞（B16-F10） 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2 藥物與試劑 白頭翁藥材，購(gòu)自河北安國(guó)，產(chǎn)地為遼寧綏中市，經(jīng)蘇州學(xué)藥學(xué)院中藥教研室李笑然教授鑒定為毛茛科白頭翁屬植物白頭翁Pulsatilla chinensis（Bge.）Regel 干燥根。白頭翁藥材經(jīng)70%乙醇回流提取3 次，1%NaOH 水溶液堿水解反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH 值，上大孔樹脂柱經(jīng)不同濃度乙醇洗脫，真空干燥，得白頭翁皂苷棕褐色粉末，提取分離純化實(shí)驗(yàn)由本部門馮育林教授完成，以白頭翁皂苷B3 為對(duì)照品，檢測(cè)總苷含有量達(dá)90%。胎牛血清（批號(hào)1740735，美國(guó)Gibco 公司）；DMEM（批號(hào)20170616，北京索萊寶科技有限公司）；TRIzol 試劑（批號(hào)119702，美國(guó)Invitrogen 公司）；RIPA 裂解液（批號(hào)20171027，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20171026，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；8%聚丙烯酰胺凝膠（批號(hào)20171026，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；PageRuler（批號(hào)00442922，美 國(guó) Thermo Fisher 公司）；電泳液（批號(hào)20171027，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；轉(zhuǎn)膜液（批號(hào)20171027，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；PVDF 膜（批號(hào)SE2372541B，美國(guó)Thermo Fisher 公司）；Difco Skim Milk（批號(hào)ser3106120，美 國(guó) BD 公 司）；Albumin from bovine serum（批號(hào)B0016K021000，白鯊生物科技有限公司）；TBS（批號(hào)20171019，北京索萊寶科技有限公司）；Tween-20（批號(hào)822L0419，北京索萊寶科技有限公司）；β-actin（批號(hào)RL240559B，美國(guó)Invitrogen 公司）；p-Akt（批號(hào)28，美國(guó)Cell Signaling 公司）；Akt（批號(hào)6，美國(guó)Cell Signaling 公司）；辣根酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 抗體（批號(hào)133499，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；山羊抗兔IgG 抗體（批號(hào)133599，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；ECL（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；RNase-Free Water（批號(hào)50207，康為世紀(jì)生物科技有限公司）；胰酶（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；乙醇（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；PBS（批號(hào)L50324，北京索萊寶科技有限公司）；異丙醇（分析純，西隴化工股份有限公司）；細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒（批號(hào)740005，美國(guó)biolegend 公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR） 試劑盒（批號(hào)1802049，德國(guó)Applied Biosystems 公司）。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序 列，INF-γ 正 向5′-CCA AGCGGCTGACTGAACTC-3′，反向5′-TGGCCCGGAGTGTAGACATC-3′；IL-6 正向5′-G TGGCTAAGGACCAAGACCA-3′，反 向 5′-ACCACAGTGAGGAATGTCCA-3′；β-actin正向5′-ATGACCCAGA TCATGTTTGA-3′，反向?yàn)?′-TACGACCAGAGGCATACAG-3′。

1.3 儀器 生物安全柜［力康儀器（上海） 有限公司，HFsahe900LC］；流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼公司，Gallios）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，L535R）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific 公司，3111）；熒光定量PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司，ABI7500）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 液氮中取出B16-F10 細(xì)胞，37℃水浴迅速?gòu)?fù)溫，轉(zhuǎn)移至離心管，離心去上清，置于含10% FBS 及1%青霉素-鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中重懸，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿皿底90%，細(xì)胞傳代培養(yǎng)或用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 小鼠皮下移植瘤模型建立、動(dòng)物分組及給藥 將40只C57BL／6 小鼠隨機(jī)分為模型組及白頭翁皂苷低、中、高劑量（100、200、400 mg／kg）組，共4組，每組10 只，另設(shè)正常組3 只。體外培養(yǎng)B16-F10 細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用1 × PBS 調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5 × 106／mL，0.2 mL／只，皮下接種于C57BL ／6 小鼠右前肢腋下。皮下接種黑色素瘤次日開始給小鼠灌胃給藥，1 次／d，連續(xù)13 d。

2.3 黑色素瘤生長(zhǎng)抑制檢測(cè) 待皮下腫瘤瘤塊長(zhǎng)到可觸程度時(shí)，使用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)和寬（即最長(zhǎng)直徑和最短直徑），1 次／d，腫瘤體積＝0.5×長(zhǎng)×寬×寬，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。末次給藥后第2 天眼眶取血，脫臼處死荷瘤小鼠，剝離瘤體稱定質(zhì)量，計(jì)算腫瘤的抑制率，腫瘤抑制率＝（1-各給藥組腫瘤質(zhì)量／模型組腫瘤質(zhì)量） ×100%。將腫瘤組織用錫箔紙包裹-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá) 正常組選取3 只動(dòng)物，其余各組每組隨機(jī)選取6 只動(dòng)物外周血血清，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α、IFN-γ 等細(xì)胞因子的表達(dá)，相關(guān)操作按照試劑盒說明進(jìn)行。

2.5 RT-PCR 檢測(cè)相關(guān)基因mRNA 的表達(dá) 每組隨機(jī)選取3 只動(dòng)物腫瘤組織，稱取30 mg 加1 mL TRIzol 試劑，冰上勻漿2 min，加入苯酚氯仿200 μL 靜置3 min，4℃、12 000 r／min離心15 min，取上清450 μL，加入異丙醇450 μL，渦旋震蕩，4℃、12 000 r／min 離心10 min，棄上清，加 入 4℃、75% 乙 醇 1 mL，渦旋震蕩，4℃、7 500 r／min離心5 min，棄上清加入RNase-Free Water 20 μL混勻，Nanodrop 儀器測(cè)定RNA 濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄mRNA 成cDNA，使用Real-time PCR 試劑盒檢測(cè)組織中IL-6、INF-γ、β-actin基因表達(dá)的變化。PCR 擴(kuò)增條件，Holding Stage，50℃、2 min，95℃、10 mins；Cycling Stage，95℃、15 s，60℃、1 min，40 cycles；Melt Curve，95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、30 s，60℃、15 s。數(shù)據(jù)由Excel 軟件分析比較得出，使用2-△△ct表示基因相對(duì)表達(dá)量。

2.6 Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) -80℃冰箱取出B16-F10 腫瘤組織，每組隨機(jī)取3個(gè)樣品，各稱取30 mg 置于200 μL 含1%PMSF 和1%新配置的磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液中，在冰上充分勻漿并反應(yīng)30 min。用BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，加入Loadding Buffer，100℃反應(yīng)5 min 使蛋白變性，分裝-80℃凍存。根據(jù)待檢測(cè)蛋白的分子量配置8%的聚丙烯酰胺凝膠，各樣品上樣30 μg 總蛋白，6 μL PageRuler，電泳90 V 恒壓集聚蛋白，120 V 恒壓分離蛋白。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，將SDS 凝膠上充分分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，恒流200 mA、4℃、2 h。然后用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。用TBST 洗膜3 次，每次5 min。修剪條帶，分別加入鼠抗β-actin（1∶1 000）、鼠抗p-Akt（1∶500）、兔抗Akt（1∶1 000） 4℃過夜。TBST 洗膜3次，每次5 min。條帶分別用辣根酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 抗體（1∶3 000）、山羊抗兔IgG 抗體（1∶3 000） 室溫孵育1 h。TBST 洗膜3 次，每次5 min。然后eECL 化學(xué)發(fā)光法顯影。使用ImageJ 軟件分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)輸入GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（） 表示，多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P≤0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 白頭翁皂苷對(duì)皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響 白頭翁皂苷連續(xù)灌胃給藥13 d 后，處死小鼠，剝離皮下移植瘤瘤體稱定質(zhì)量，結(jié)果顯示，與模型組比較，各白頭翁皂苷給藥組腫瘤瘤重均減小（P＜0.05）。低、中、高劑量組抑瘤率分別達(dá)到30.62%、46.15%、37.65%。腫瘤生長(zhǎng)曲線也顯示各給藥組腫瘤體積均持續(xù)顯著小于模型組，見表1、圖1。

表1 白頭翁皂苷對(duì)荷瘤小鼠腫瘤影響（， n＝10）

表1 白頭翁皂苷對(duì)荷瘤小鼠腫瘤影響（， n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 白頭翁皂苷對(duì)荷瘤小鼠血清中細(xì)胞因子的影響 與正常組相比，模型組小鼠血清IL-6 水平增加（P＜0.05）；TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，白頭翁皂苷低、高劑量組IL-6 水平下降，白頭翁皂苷低、中、高劑量組INF-γ 水平下降（P＜0.05，P＜0.01），見圖2。

圖1 白頭翁皂苷對(duì)荷瘤小鼠瘤體影響

3.3 白頭翁皂苷對(duì)腫瘤組織中炎癥因子的影響 基于白頭翁皂苷下調(diào)荷瘤小鼠血清中炎癥因子IL-6 和INF-γ 表達(dá)的結(jié)果，本研究采用RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)了荷瘤小鼠腫瘤組織中IL-6 和INF-γmRNA 表達(dá)，結(jié)果顯示，與模型組相比，白頭翁皂苷高劑量組IL-6 mRNA 表達(dá)下降，白頭翁皂苷中、高劑量組INF-γmRNA 表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01），與血清中INF-γ 和IL-6 的表達(dá)結(jié)果相一致，見圖3。

3.4 白頭翁皂苷對(duì)腫瘤組織中Akt 信號(hào)通路的影響 白頭翁皂苷連續(xù)灌胃13 d 后，與模型組相比，白頭翁皂苷高劑量組p-Akt 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖4。

4 討論

中藥抗腫瘤是抗腫瘤藥物研究方向之一，其副作用低的優(yōu)勢(shì)也使得中藥在抗腫瘤方面有著不可替代的作用，已報(bào)道［6-8］白頭翁具有抗腫瘤的作用，但其是否能通過炎癥途徑抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展還不明確。炎癥在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色，炎癥反應(yīng)的持續(xù)存在促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生及惡性轉(zhuǎn)化。本研究從炎癥角度探討白頭翁活性成分白頭翁皂苷體內(nèi)抗腫瘤的作用和機(jī)制，結(jié)果顯示白頭翁皂苷可以顯著抑制荷瘤小鼠皮下黑色素瘤的生長(zhǎng)，下調(diào)荷瘤小鼠血清中IL-6、IFN-γ 等炎癥因子及下調(diào)腫瘤組織中的IL-6、IFN-γ 水平，同時(shí)，抑制了腫瘤組織中Akt 的磷酸化。

IL-6 是一種可由多種細(xì)胞分泌的促炎因子，在多種惡性腫瘤中檢測(cè)出IL-6 高表達(dá)，其在炎癥與腫瘤聯(lián)系中發(fā)揮重要作用［9］。IL-6 除了參與維持慢性炎癥狀態(tài)和致癌微環(huán)境外，還通過誘導(dǎo)T 細(xì)胞等免疫細(xì)胞分化，降低免疫細(xì)胞活性，促使癌細(xì)胞能夠逃避抗癌免疫反應(yīng)。腫瘤內(nèi)的IL-6能激活多種信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和存活，加速腫瘤血管新生和轉(zhuǎn)移，對(duì)腫瘤的進(jìn)展起到促進(jìn)作用［10］。IL-6 可誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并隨后促進(jìn)硬性顱咽管瘤的轉(zhuǎn)移［11］。眾多研究表明，乳腺癌［12-13］、卵巢癌［14］、胃癌［15］等多種腫瘤中高表達(dá)IL-6，且往往與患者的預(yù)后不良相關(guān)。IL-6 促腫瘤的機(jī)制可能是IL-6 分泌后與受體IL-6R 結(jié)合為IL-6／IL-6R 復(fù)合物，通過募集信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亞基gp130 激活PI3K／Akt 途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活和多藥耐藥性［16-17］。本研究也表明在皮下接種B16-F10 腫瘤后，與空白組相比，模型組荷瘤小鼠血清中IL-6 水平顯著升高。經(jīng)白頭翁皂苷灌胃治療后，與模型組相比，給藥組血清（低、高劑量組） 及腫瘤中（高劑量組） IL-6 水平顯著降低，表明白頭翁皂苷可以抑制黑色素瘤荷瘤小鼠血清和腫瘤中IL-6 的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤進(jìn)展。

圖2 白頭翁皂苷對(duì)荷瘤小鼠外周血中IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α、INF-γ 水平的影響（正常組n＝3，其余組n＝6）

TNF-α 是腫瘤炎癥微環(huán)境中由多種基質(zhì)細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的一種炎癥細(xì)胞因子，其可以通過自分泌和旁分泌的方式，引起促炎作用及免疫調(diào)節(jié)。越來越多的研究表明TNF-α 對(duì)腫瘤的進(jìn)展起到促進(jìn)而非抑制的作用。炎癥微環(huán)境中的TNF-α 能夠直接促進(jìn)腫瘤的形成生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，也能通過促進(jìn)腫瘤血管的生成促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［18］。Shang 等［19］研究發(fā)現(xiàn)TNF-α 可誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)肺癌的轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步支持這種觀點(diǎn)。Yu 等［20］通過對(duì)360 例胃癌患者的研究發(fā)現(xiàn)TNF-α 基因的GA308 基因型是胃癌的易感基因。Zhu 等［21］研究表明膽囊癌細(xì)胞中自分泌TNF-α的減少可以對(duì)細(xì)胞在體外生長(zhǎng)和遷移的能力產(chǎn)生抑制作用，沉默TNF-α 基因能降低Akt 表達(dá)和磷酸化。這些研究都指向TNF-α 起到促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用。本研究顯示，白頭翁皂苷高劑量降低荷瘤小鼠血清中TNF-α 水平。提示白頭翁皂苷可能通過下調(diào)黑色素瘤荷瘤小鼠血清中的TNF-α 表達(dá)，從而抑制腫瘤發(fā)展。

圖3 白頭翁皂苷對(duì)荷瘤小鼠腫瘤中IL-6 和INF-γ mRNA 表達(dá)的影響（n＝3）

圖4 白頭翁皂苷對(duì)荷瘤小鼠腫瘤中p-Akt 蛋白表達(dá)的影響（n＝3）

IFN-γ 是一種由活化的T 細(xì)胞、天然殺傷（NK） 細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，其在腫瘤微環(huán)境中起多種作用。有研究認(rèn)為IFN-γ 是抗腫瘤細(xì)胞因子［22］，但也有大量證據(jù)表明該分子具有促進(jìn)胃癌［23］、黑色素瘤［24］、卵巢癌［25］等多種腫瘤進(jìn)展的作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ 刺激的原代口腔上皮細(xì)胞獲得了癌干細(xì)胞的一些特性，IFN-γ具有誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力，IFN-γ 信號(hào)可能與口腔扁平苔蘚的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)［26］。這些研究都表明IFN-γ 對(duì)腫瘤的進(jìn)展起到促進(jìn)作用，而這一功能可能是通過調(diào)控Akt 信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。IFN-γ 可通過增強(qiáng)CD74 的表達(dá)，激活黑素瘤中的PI3K／Akt 途徑，促進(jìn)腫瘤存活［24］。本實(shí)驗(yàn)也得到類似的結(jié)果，B16-F10 腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)使得荷瘤小鼠血清中的IFN-γ 水平增加。白頭翁皂苷給藥治療后，與模型組相比，白頭翁皂苷（低、中、高劑量組） 降低荷瘤小鼠血清IFN-γ 水平，白頭翁皂苷（中、高劑量組） 抑制荷瘤小鼠腫瘤IFN-γmRNA 表達(dá)，表明白頭翁皂苷可能通過抑制IFN-γ 表達(dá)，從而抑制腫瘤發(fā)展。

Akt 是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K 下游重要蛋白，磷酸化激活后可以通過多種途徑促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［27］。Akt 被磷酸化激活后，對(duì)炎癥的調(diào)節(jié)具有重要作用，可調(diào)控包括IL-6、TNF-α 和INF-γ［28-29］在內(nèi)的多種促炎因子的表達(dá)。同時(shí)，Akt 信號(hào)通路也受包括IL-6［16］、TNF-α［21］、INF-γ［24］在內(nèi)的多種炎癥因子調(diào)控，這就形成了Akt 信號(hào)通路與炎癥因子相互促進(jìn)的正向循環(huán)，從而維持局部炎性微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示，白頭翁皂苷能顯著抑制Akt 的磷酸化激活，抑制腫瘤的進(jìn)展。

綜上，白頭翁皂苷可通過抑制炎癥因子表達(dá)等多種途徑抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，這可能是通過抑制Akt 的磷酸化，從而抑制IL-6、TNF-α、IFN-γ 等炎癥因子的表達(dá)，改善了腫瘤炎癥微環(huán)境，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)展，具體的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。