李曉雯 王春麗

（華東理工大學(xué)藥學(xué)院， 制藥工程與過程化學(xué)教育部工程研究中心， 上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海200237）

酪氨酸酶即多酚氧化酶，常見于人體和動、植物體內(nèi)，微生物中也能見到［1］，對黑色素代謝、兒茶酚胺有很大影響，能在一定程度上限制其代謝速度［2］。在酪氨酸酶單酚酶的刺激下，酪氨酸會發(fā)生羥化反應(yīng)，生成鄰位二羥基苯丙氨酸（L-多巴），而在二酚酶作用下后者會發(fā)生氧化反應(yīng)，生成多巴醌，繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)后就會形成黑色素［3］。因此，只要在酪氨酸酶發(fā)生反應(yīng)的過程中抑制其活性，就可減少黑色素的形成，從而達(dá)到美白效果。

金露梅Potentilla fruticosaL.是薔薇科委陵菜屬灌木類植物［4］，為西藏常見藥物，因其生長環(huán)境的溫差較大、海拔較高、日照時(shí)間較長，其成分組成多樣，活性極強(qiáng)［5］，包括黃酮類、三萜類、多糖類、鞣質(zhì)、醌類等［6］。多酚作為一種廣泛應(yīng)用于美白產(chǎn)品的酪氨酸酶抑制劑，既可與底物競爭，結(jié)合酪氨酸酶，也可抑制酶反應(yīng)活性，從而減少黑色素生成以達(dá)到美白祛斑的作用［7］。目前，對金露梅總多酚含有量及其抑制酪氨酸酶活性的報(bào)道較少［8］，故本實(shí)驗(yàn)考察該植物在酪氨酸酶催化中的抑制機(jī)理，以期為相關(guān)美白產(chǎn)品的研發(fā)提供科學(xué)根據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 金露梅采自西藏，經(jīng)華東理工大學(xué)馬磊副教授鑒定為正品。酪氨酸酶（美國Worthington 公司，1 080 U／mg）；L-多巴、L-酪氨酸對照品［阿拉丁試劑（上海） 有限公司］。無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器 JY5002 電子天平（上海復(fù)平儀器儀表有限公司）；WK-400B 高速藥物粉碎機(jī)（山東精誠機(jī)械有限公司）；SHZ-3 循環(huán)水多用真空泵、HH-WO 電子恒溫水浴鍋（上海予華儀器有限公司）；PS-30AL 超聲波清洗儀（深圳市潔康有限公司）；UV1900 紫外分光光度計(jì)（上海奧譜勒儀器有限公司）。

2 方法

2.1 總多酚制備與含有量測定

2.1.1 提取 稱取金露梅全株5.0 g，粉碎處理后以30目篩進(jìn)行篩選，置于錐形瓶中，加入100 mL 50%乙醇，50℃下超聲提取30 min，得到粗提物，60℃下減壓蒸餾除去乙醇，置于100 mL 量瓶中定容，即得金露梅總多酚提取物，質(zhì)量濃度為50 g／L［9］。

2.1.2 分離純化 采用HZ-828 大孔樹脂，5 g／L 提取液以1.0 mL／min 體積流量上樣50 mL，進(jìn)行動態(tài)吸附，50 mL 70%乙醇進(jìn)行動態(tài)洗脫，洗脫液減壓蒸餾濃縮，即得純化物［10］。

2.1.3 定量測定 采用福林酚測定法［11］。精密稱取10 mg沒食子酸對照品，離子水溶解并定容至100 mL，得0.1 mg／mL 溶 液，取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL于25 mL 量瓶中（終質(zhì)量濃度分別為4、6、8、10、12、14、16 μg／mL），加入1 mL 福林酚試劑、2 mL 10%Na2CO3試劑，搖勻定容，25℃下反應(yīng)1 h 后，測定其在最大吸收波長765 nm 波長處的吸光度（A765）。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A） 進(jìn)行回歸，得到方程 為A＝0.131 3X-0.008 4（R2＝0.999 1），在0～16 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

將“2.1.2” 項(xiàng)下純化物在60℃下通過減壓蒸餾除去乙醇，去離子水定容至5 g／L，取1.0 mL，去離子水定容于10 mL 量瓶中，再量取0.5 mL 于25 mL 量瓶中，依次加入1 mL 福林酚試劑、2 mL 10% Na2CO3溶液，混勻，定容，2 5℃下反應(yīng)1 h 后，測定A765。

結(jié)果，金露梅純化后總多酚含有量為171.13 mg／g，終藥液濃度為10 μg／mL。

2.2 酶活性測定 對酪氨酸酶活性進(jìn)行檢測的前提是多巴色素最大吸收峰在475 nm 波長處，而多巴色素來自于酪氨酸、L-多巴的酶催化氧化反應(yīng)［12］。酪氨酸酶反應(yīng)活性定義［13］為以每1 min 多巴色素在475 nm 波長處的吸光度（A475） 增加0.001，為1個(gè)酶活性單位，即1 U／min，可依據(jù)酶催化反應(yīng)系統(tǒng)A475伴隨時(shí)間的增長，得到對應(yīng)的酶活性值。

2.2.1 單酚酶活性 參考文獻(xiàn)［14］報(bào)道。以1.5 mmol／LL-酪氨酸為底物，在反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)依次加入3.1 mL 磷酸緩沖液（pH＝6.8）、1.5 mL 5.0 mmol／LL-酪氨酸（溶于pH ＝6.8 磷酸鹽緩沖液中），在28℃恒溫水浴鍋中恒溫10 min，依次加入0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g／L 金露梅提取物各0.2 mL 及酪氨酸酶溶液0.2 mL，搖晃均勻后迅速置于紫外分光光度計(jì)中，在475 nm 波長處每30 s 讀取1 次吸光度，連續(xù)15 min。在該反應(yīng)體系中，酶終質(zhì)量濃度為20 mg／L。

2.2.2 二酚酶活性 參考文獻(xiàn)［15］報(bào)道。以1.0 mmol／LL-多巴為底物，在此反應(yīng)體系內(nèi)依次加入3.6 mL 磷酸緩沖液（pH＝6.8）、1.0 mL 5.0 mmol／LL-多巴（溶于pH ＝6.8磷酸鹽緩沖液中），在28℃恒溫水浴鍋中恒溫10 min，依次加入0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g／L 金露梅提取物各0.2 mL 及酪氨酸酶溶液0.2 mL，搖晃均勻后迅速置于紫外分光光度計(jì)中，在475 nm 波長處每30 s 讀取1 次吸光度，連續(xù)15 min。在該反應(yīng)體系中，酶終質(zhì)量濃度為4.0 mg／L。

2.2.3 計(jì)算方法 公式為相對酶活性＝［（A2-A1）／（A4-A3）］×100%，其中A1、A2分別為底物、酪氨酸酶與金露梅提取物溶液在一定時(shí)間段內(nèi)（單酚酶活性5～10 min，二酚酶活性0～6 min） 對應(yīng)的吸光度；A3、A4表示存在前2 種物質(zhì)，但不存在金露梅提取物體系在1個(gè)時(shí)間間隔內(nèi)的前后吸光度，時(shí)間段選擇一致［16］。

2.3 金露梅對酪氨酸酶二酚酶活性抑制機(jī)理的分析 固定酪氨酸酶活性為66 U／mL，在反應(yīng)體系內(nèi)依次加入磷酸鹽緩沖液（pH＝6.8）、L-多巴溶液、金露梅50%乙醇提取物各1 mL，置于水浴鍋中，28℃下恒溫10 min，再加入1 mL酪氨酸酶溶液，搖晃均勻迅速置于紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行檢測。改 變L-多巴溶液濃度為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol／L，測定0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g／L 金露梅提取物A475，計(jì)算初速度V0，繪制濃度-初速度曲線。再利用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)方程，由底物L(fēng)-多巴溶液濃度、V0倒數(shù)為指標(biāo)作圖，測得米氏常數(shù)Km、酶促反應(yīng)最大速率Vm，用來判斷其抑制種類［17］。

以Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)方程直線斜率、截距為縱坐標(biāo)，提取物溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)再繪圖，得到對應(yīng)的抑制常數(shù)KI、KIS［18］。V0-1＝Km·Vm-1（1＋CI·KI-1）CS-1＋Vm-1（1＋CI·KIS-1），其中V0為初速度，單位A／min；Km為米氏常數(shù)，單位mmol／L；Vm為最大反應(yīng)速率，單位A／min；CI為金露梅提取物質(zhì)量濃度，單位g／L；CS為底物濃度，單位mmol／L；KI為金露梅提取物與酶的反應(yīng)常數(shù)，單位g／L；KIS為金露梅提取物和酶-底物絡(luò)合物發(fā)生反應(yīng)的常數(shù)，單位g／L［19］。

3 結(jié)果

3.1 金露梅提取物對酪氨酸酶單酚酶活性的影響 在單酚酶活性測定時(shí)使用酪氨酸酶，通常情況下能減緩其催化反應(yīng)而出現(xiàn)遲滯時(shí)間，同時(shí)在反應(yīng)系統(tǒng)中酶、底物濃度能影響延遲時(shí)間［20］。按“2.2” 項(xiàng)下方法測定A475，金露梅提取物對酪氨酸酶單酚酶作用的進(jìn)程曲線見圖1。由此可知，單酚酶活性存在遲滯時(shí)間（曲線的直線部分交于橫坐標(biāo)的值）［21］，在反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)提取物可讓其活動延遲時(shí)間增加，而且質(zhì)量濃度越高，延遲時(shí)間越長，曲線斜率減小，即穩(wěn)態(tài)酶活性下降，表明它可在一定程度上抑制酪氨酸酶單酚酶的活性，縮減其效用。

金露梅提取物存在濃度差異時(shí)，會對酪氨酸酶催化氧化反應(yīng)有影響，從而改變其L-酪氨酸的穩(wěn)態(tài)酶活性（即5～10 min的相對酶活性）。圖2 顯示，隨著提取物溶液質(zhì)量濃度升高，穩(wěn)態(tài)酶活性降低，IC50約為3.74 g／L。

圖2 金露梅提取物對酪氨酸酶單酚酶穩(wěn)態(tài)酶活性的影響

3.2 金露梅提取物對酪氨酸酶二酚酶活性的影響 按“2.2” 項(xiàng)下方法測定A475，結(jié)果見圖3。由此可知，二酚酶催化氧化L-多巴過程中無時(shí)間延遲，隨著提取物溶液質(zhì)量濃度升高，曲線斜率明顯增長，表明它可在一定程度上抑制二酚酶反應(yīng)；在提取物溶液質(zhì)量濃度相同的反應(yīng)體系中，吸光度會隨著時(shí)間延長而增大，但速率逐漸下降，表明二酚酶對氧化反應(yīng)的催化速度變小。

圖3 金露梅提取物對酪氨酸酶二酚酶作用的進(jìn)程曲線

金露梅提取物質(zhì)量濃度存在差異時(shí)，會給酪氨酸酶催化氧化反應(yīng)造成影響，改變其L-多巴的穩(wěn)態(tài)酶活性（即0～6 min 的相對酶活性）。圖4 顯示，隨著提取物溶液質(zhì)量濃度不斷升高，穩(wěn)態(tài)酶活性降低，IC50約為4.31 g／L。

圖4 金露梅提取物對酪氨酸酶二酚酶穩(wěn)態(tài)酶活性的影響

3.3 金露梅抑制酪氨酸酶二酚酶活性的機(jī)理 按“2.2”項(xiàng)下方法測定A475，計(jì)算初速度V0，繪制濃度-初速度曲線，結(jié)果見圖5。由此可知，隨著多巴溶液濃度升高，V0不斷增長；金露梅提取物溶液質(zhì)量濃度變化對酪氨酸酶二酚酶活性有不同程度的抑制作用，而且隨著其質(zhì)量濃度升高，與二酚酶的反應(yīng)逐漸穩(wěn)定，表明提取物會與底物競爭與酶結(jié)合，催化速率的下降是酶活性被抑制的后果，而不是因?yàn)槊竼适Щ钚栽斐傻摹Ｒ虼?，可認(rèn)為金露梅提取物對酪氨酸酶的作用為可逆性抑制［22］。

以底物L(fēng)-多巴溶液質(zhì)量濃度、V0倒數(shù)為指標(biāo)，結(jié)合Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)方程進(jìn)行擬合，結(jié)果見圖6，對比酶催化反應(yīng)的相應(yīng)動力指數(shù)，通過表觀米氏常數(shù)（Km）、最大反應(yīng)速度（Vm） 來判斷抑制類型［23］。由圖6A 可知，雙倒數(shù)圖中的1組直線在第二象限內(nèi)交叉于一點(diǎn)，Km、Vm都隨提取物溶液質(zhì)量濃度的升高而變化，Km增加，Vm值減少，表明提取物對酪氨酸酶的抑制機(jī)理為混合型效應(yīng)，即它與酶在不斷作用的過程中可同時(shí)與游離酶和酶-底物的絡(luò)合物結(jié)合，從而發(fā)生非競爭性抑制反應(yīng)，并且與L-多巴在相互競爭中和酪氨酸酶發(fā)生反應(yīng)而形成競爭性抑制。

圖5 金露梅提取物溶液質(zhì)量濃度與其抑制作用的關(guān)系

根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)方程的斜率、縱截距，結(jié)合金露梅提取物溶液質(zhì)量濃度來制圖，用于判斷結(jié)合度，結(jié)果見圖6B、6C。由此可知，提取物對游離酶的抑制常數(shù)（KI）為3.76 g／L，而對酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)（KIS） 為8.65 g／L，即它與游離酶的反應(yīng)程度高于與酶-底物絡(luò)合物的。

圖6 金露梅提取物對酪氨酸酶催化氧化L-多巴抑制作用的Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)方程

4 結(jié)論

金露梅50%乙醇提取物經(jīng)大孔樹脂純化后，總多酚含有量為171.13 mg／g，可在一定程度上抑制酪氨酸酶活性，并對單酚酶、二酚酶均存在顯著的抑制作用，它抑制單酚酶反應(yīng)遲滯時(shí)間的延長是主要表現(xiàn)，當(dāng)后者活性降低到一半時(shí)其IC50約為3.74 g／L，而對二酚酶約為4.31 g／L。通過Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)圖發(fā)現(xiàn)，提取物對二酚酶存在混合型抑制作用，對游離酶、及酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)分別為3.76、8.65 g／L，表明它具有良好的美白活性，今后可對其主要有效成分及細(xì)胞生物學(xué)方面進(jìn)行深入研究。