劉 藝朱啟勇諶曉莉肖慶齡*鞠建明*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院， 江蘇 南京210028； 2.江蘇省中醫(yī)藥研究院， 江蘇 南京210028）

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同發(fā)揮療效的特點(diǎn)，在研究其提取工藝的過(guò)程中傾向于采用能反映整體提取效果的指標(biāo)，而不是某一種或一些指標(biāo)成分［1-2］。指紋圖譜作為一種綜合、整體、可量化的定性定量分析手段，能較好地體現(xiàn)復(fù)方制劑中各類成分與療效的相關(guān)性，國(guó)內(nèi)外主要將其用于成分分析和質(zhì)量控制研究［3-10］。由于中藥復(fù)方提取物成分復(fù)雜、各成分權(quán)重系數(shù)難以確定，故需要結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。主成分分析常被應(yīng)用于綜合評(píng)價(jià)［11-12］，基于其方差最大原則，把數(shù)據(jù)中的自變量進(jìn)行歸一化處理，減少相互重疊信息，即降維思想，同時(shí)將多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)，用于反映大部分信息。肺纖方為江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院全國(guó)名老中醫(yī)朱啟勇主任的臨床驗(yàn)方，由丹參、赤芍、桃仁、水蛭、麥冬、木蝴蝶等藥材組成，具有補(bǔ)肺腎陰、化肺絡(luò)瘀之功效，臨床上用于治療陰虛血瘀引起的肺間質(zhì)纖維化，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上聯(lián)合其治療時(shí)可使動(dòng)脈血?dú)狻⒎喂δ?、癥狀積分明顯改善，療效顯著。但該方劑型為湯劑，患者使用不便，故擬按照醫(yī)院制劑備案技術(shù)要求，在物質(zhì)基礎(chǔ)不發(fā)生改變的前提下將其開(kāi)發(fā)為顆粒劑。本實(shí)驗(yàn)遵循中醫(yī)傳統(tǒng)采用水提取方法，依據(jù)中藥復(fù)方制劑整體性的特點(diǎn)，將指紋圖譜技術(shù)與主成分分析相結(jié)合優(yōu)化肺纖方提取工藝，以期將該方開(kāi)發(fā)成醫(yī)院制劑、服務(wù)廣大患者奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Waters 高效液相色譜儀，配置Alliance 2695 四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、2996 二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；Milli-Q型純水器（美國(guó)Millipore 公司）；AT201型電子天平（十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Buchi-200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）。

1.2 試劑與藥物 丹參（批號(hào)20180401-04） 購(gòu)自貴州同德藥業(yè)有限公司；水蛭（批號(hào)170824） 購(gòu)自南京松齡中藥飲片有限公司；桃仁（批號(hào)1708010）、赤芍（批號(hào)1802003）、麥冬（批號(hào)1804011） 購(gòu)自亳州市萬(wàn)珍中藥飲片廠；木蝴蝶（批號(hào)20170724） 購(gòu)自南京松齡中藥飲片有限公司，均由江蘇省中醫(yī)藥研究院錢士輝研究員鑒定為正品，符合2015 版《中國(guó)藥典》 一部相關(guān)規(guī)定。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取液制備 稱取方中各味藥材共9 份，每份含藥量為114 g，置于圓底燒瓶中，按照表1 因素水平回流提取后，考察料液比（A）、煎煮時(shí)間（B）、煎煮次數(shù)（C） 對(duì)提取效果的影響，合并后濃縮至500 mL，冷藏備用。

表1 因素水平

2.2 供試品溶液制備 精密吸取 “2.1” 項(xiàng)下提取液5 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL 量瓶中，超聲（功率250 W） 處理30 min，放冷，定容后搖勻，12 000 r／min離心10 min，即得。

2.3 色譜條件奧泰AlltimaTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脫（0～20 min，2%～3% 乙腈；20～21 min，3%～6% 乙腈；21～41 min，6%～14%乙腈；41～71 min，14%～27%乙腈；71～86 min，27%～45% 乙腈）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.4 精密度試驗(yàn) 按照2015 年版《中國(guó)藥典》 方法進(jìn)行考察，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得33個(gè)共有峰保留時(shí)間RSD 為0.04%～1.48%，峰面積RSD 為0.32%～1.95%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按照2015 年版《中國(guó)藥典》 方法進(jìn)行考察，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得33個(gè)共有峰保留時(shí)間RSD 為0.63%～2.66%，峰面積RSD 為0.02%～1.22%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照2015 年版《中國(guó)藥典》 方法進(jìn)行考察（24 h 內(nèi)），在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得33個(gè)共有峰保留時(shí)間RSD 為0.15%～1.36%、峰面積RSD為0.54%～2.98%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 HPLC 指紋圖譜建立 精密吸取9 份“2.2” 項(xiàng)下供試品溶液，每份10 μL，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A 版）對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行分析，采用中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜（R），共標(biāo)定33個(gè)共有峰，見(jiàn)圖1。

圖1 9 批樣品HPLC 指紋圖譜

2.8 共有色譜峰的標(biāo)識(shí)及歸屬分析 精密稱取方中處方量藥材（水蛭主要包含蛋白質(zhì)和氨基酸，故未對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)），置于圓底燒瓶中，加12 倍量水回流提取2 次，每次60 min，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，記錄色譜圖，確認(rèn)共有峰藥材歸屬，結(jié)果見(jiàn)圖2。確認(rèn)了28個(gè)共有峰的來(lái)源，分別來(lái)自丹參（10、16、17、25、30、32 號(hào)峰）、麥冬（7、18、19、20 號(hào)峰）、赤芍（1、2、3、5、24、26 號(hào)峰）、桃仁（9、14、15 號(hào)峰）、木蝴蝶（11、13、14、21、27、28、29、31、33 號(hào)峰）。

圖2 肺纖方及組成藥材的HPLC 色譜圖

2.9 數(shù)據(jù)處理

2.9.1 主成分分析 將表1 數(shù)據(jù)錄入SPSS 22.0 軟件進(jìn)行因子分析，得到可以代表原始峰面積的主成分、貢獻(xiàn)率及解釋的總方差，見(jiàn)表2。主成分個(gè)數(shù)的提取原則為篩選特征值大于1 者［13］，故前6 種成分的初始特征值分別為17.678、5.876、3.606、2.539、1.477、1.073，方差貢獻(xiàn)率分別為 53.569%、17.807%、10.927%、7.694%、4.477%、3.251%，累積方差貢獻(xiàn)率為97.725%，包含了大部分相關(guān)信息。

將第1～3 主成分作為變量，建立三維投影圖載荷圖（圖3），在投影圖中距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的點(diǎn)為權(quán)重較大的成分。在第1、第2 主成分中，峰1～6、8～18、20、22、25～26、30～31、33 的系數(shù)較大，可反映上述色譜峰的相關(guān)信息；同理，第3 主成分主要反映了峰7、23 的相關(guān)信息。

圖3 各主成分載荷圖

表2 各主成分總方差

2.9.2 正交試驗(yàn)分析 以提取指紋圖譜共有峰主成分所得綜合評(píng)分（F） 為評(píng)價(jià)指標(biāo)，主成分得分＝主成分因子得分× 相應(yīng)方差算數(shù)平方根［14］，即F＝0.535 69F1＋0.178 07F2＋0.109 27F3＋0.076 94F4＋0.044 77F5＋0.032 51F6；料液比（A）、提 取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C） 為影響因素，正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 方差分析

由表3 可知，各因素影響程度依次為A＞B＞C，理論最優(yōu)工藝為A3B3C3；由表4 可知，各因素均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。綜合考慮時(shí)間、成本等各方面因素，最終確定最優(yōu)工藝為A3B2C2，即加12 倍量水提取2 次，每次60 min。

2.9.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)處方比例稱取3 份藥材，按“2.8.2” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝提取，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各共有峰面積主成分綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表5。由此可知，工藝穩(wěn)定可行，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

3 討論

中藥復(fù)方發(fā)揮藥效的關(guān)鍵，在于其多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用。因此，在選擇中藥復(fù)方最優(yōu)提取工藝的過(guò)程中，如果只選用某一或某幾種成分的含有量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，則無(wú)法反映全方整體提取水平。

指紋圖譜是一種評(píng)價(jià)中藥復(fù)雜成分體系質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的有效手段，能較好地反映其整體上的相近程度，包括以峰面積、相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積為指標(biāo)進(jìn)行定性和半定量分析，在中藥復(fù)方提取工藝優(yōu)化中具有一定優(yōu)勢(shì)［15］。本實(shí)驗(yàn)比較了不同梯度甲醇-水、乙腈-水的分離效果，確定文中色譜條件；通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（A版） 對(duì)9 批樣品HPLC 指紋圖譜進(jìn)行分析，得到對(duì)照指紋圖譜（R） 及33個(gè)共有峰，并將其作為提取工藝優(yōu)化指標(biāo)。方法學(xué)研究結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)所建立的方法具有良好的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性，可用于指標(biāo)成分定量分析。

考慮到各組分權(quán)重系數(shù)難以確定，本實(shí)驗(yàn)采用主成分分析，將高維數(shù)據(jù)降到低維，把33個(gè)共有峰組合成6個(gè)涵蓋了原始色譜峰97.725%信息的綜合指標(biāo)，從而較好地濃縮、簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步正交試驗(yàn)極差分析和方差分析奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了肺纖方HPLC 指紋圖譜，并與主成分分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法相結(jié)合，用未知結(jié)構(gòu)成分的模糊數(shù)據(jù)（特征色譜峰的總因子得分） 進(jìn)行多指標(biāo)的綜合評(píng)定，從而優(yōu)化該方提取工藝。該方法既全面反映了藥材整體提取水平，又在數(shù)據(jù)處理方面簡(jiǎn)單易行，具有較好的實(shí)用性和借鑒意義。