劉 雷 馬玉坤 孫 宇 劉 琦 張金玲 郭麗娜 劉吉成

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾161006）

狼毒大戟為大戟科大戟屬植物狼毒大戟Euphorbia fischerianaSteud.的干燥根［1］，狼毒大戟始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦、辛，性平，有毒，具有泄水逐飲、破積殺蟲(chóng)的功效，主治水腫腹脹、痰食蟲(chóng)積、心腹疼痛、結(jié)核、疥癬等，臨床上常用來(lái)治療腫瘤、癲癇等［2］。狼毒大戟在我國(guó)資源豐富，主要分布于黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古等地。

研究表明，狼毒大戟中所含有的二萜內(nèi)酯類為其主要活性成分。其中松香烷型二萜的研究報(bào)到較多，目前已經(jīng)從狼毒大戟中分離發(fā)現(xiàn)27個(gè)松香烷型二萜類化合物［3］。在這些化合物中，巖大戟內(nèi)酯A（Jolkinolide A，JA）、17-羥基-巖大戟內(nèi)酯A（17-hydroxyjolkinolide A，17-JA）、巖大戟內(nèi)酯B（Jolkinolide B，JB）、7-羥基-巖大戟內(nèi)酯B（17-hydroxyjolkinolide B，17-JB），4個(gè)化合物為其主要活性成分。Xu 等［4］研究發(fā)現(xiàn)JB 對(duì)PI3K／Akt／mTOR 信號(hào)通路有較強(qiáng)的抑制作用，能夠顯著誘導(dǎo)mcf-7 細(xì)胞凋亡。Wang 等［5］研究發(fā)現(xiàn)JB 可以通過(guò)下調(diào)PI3K／Akt 和IAP 家族蛋白來(lái)促進(jìn)U937 細(xì)胞的凋亡，此外，caspase-3 和caspase-9 激活的觸發(fā)介導(dǎo)了凋亡誘導(dǎo)。Takuhiro 等［6］研究發(fā)現(xiàn)17-JB 可有效抑制LPS 誘導(dǎo)的炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，如前列腺素E2（PGE2）、一氧化氮（NO） 和促炎細(xì)胞因子，表明17-JB 在巨噬細(xì)胞中具有抗炎作用，并且可以為炎癥疾病提供潛在的治療方法。Wang 等［7］發(fā)現(xiàn)17-JA 對(duì)RANKL 誘導(dǎo)的原代骨髓巨噬細(xì)胞（BMMS） 破骨細(xì)胞的形成有明顯的抑制作用，通過(guò)阻止破骨細(xì)胞的形成及其骨吸收活性，對(duì)骨丟失具有抑制作用。

由于JA、17-JA、JB 及17-JB 具有廣泛的生物活性，因此對(duì)其進(jìn)行定量分析對(duì)控制狼毒大戟藥材質(zhì)量具有重要意義。目前，已報(bào)導(dǎo)的狼毒大戟藥材的指標(biāo)成分定量檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、液相色譜法及液相-質(zhì)譜聯(lián)用法［8-10］等?；|(zhì)分散固相萃取（MSPD） 技術(shù)是1989 年提出的新型前處理方法［11］。該方法的優(yōu)勢(shì)是將樣品的破碎、提取及分離集成于一個(gè)步驟中，再根據(jù)目標(biāo)分析物的分子結(jié)構(gòu)特征及分散劑的不同性質(zhì)，通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選擇出最佳的分散劑及洗脫溶劑，利用研缽及分散劑將樣品磨碎并充分混勻，之后，再用適合的流動(dòng)相洗脫，將目標(biāo)分析物洗脫出并進(jìn)行色譜定量分析。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不需要加熱處理，這種溫和的萃取條件可以避免目標(biāo)分析物的降解，過(guò)程操作簡(jiǎn)便沒(méi)有過(guò)多的樣品轉(zhuǎn)移減少目標(biāo)分析物的損失。近年來(lái)，MSPD 法已成功地應(yīng)用于藥用植物材料中多種活性物質(zhì)的提取，為藥用植物樣品前處理提供了一種有效、簡(jiǎn)便的方法［12-14］。本研究的目的是建立一種實(shí)用、簡(jiǎn)便、快速的方法，利用基質(zhì)分散固相萃取法處理狼毒大戟藥材，采用UPLC 法檢測(cè)其中的松香烷型二萜JA、17-JA、JB 及17-JB 的含有量，以期為狼毒大戟藥材的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料

Waters Acquity UPLC Class 超高效液相色譜儀（配有四元泵、真空脫氣機(jī)，樣品管理器、PDA 二極管陣列檢測(cè)器及Empower 3 色譜工作站）、色譜柱采用Waters BEH-C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）反相柱（美國(guó)Waters 公司）；Merck Millipopre Synergy 制水系統(tǒng)（德 國(guó)Merck 公 司）；Eppendorf 5417R 高速離心機(jī)（德 國(guó) Eppendorf 公 司）；Branson 3800型超聲清洗器（美國(guó)Branson 公司）。

對(duì)照品JA、17-JA、JB 及17-JB 由本實(shí)驗(yàn)室自制，其1H-NMR、13C-NMR、MS 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致［15］，純度經(jīng)HPLC 檢測(cè)大于98%。乙腈及甲醇（色譜級(jí)） 均購(gòu)自于德國(guó)默克公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。硅膠（200～300目） 購(gòu)于山東青島海洋公司；C18填料（平均粒徑50 μm）購(gòu)于日本YMC 公司；中性氧化鋁（200～300目）、佛羅里硅土（100～200目） 購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。

不同地區(qū)采集的狼毒大戟藥材3 份，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院中藥教研室郭麗娜教授鑒定為大戟科植物狼毒大戟Euphorbia fischerianaSteud.的干燥根。標(biāo)本保存于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取4 種目標(biāo)分析物對(duì)照品適量，置于25 mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成每1 mL 分別含JA、17-JA、JB、17-JB、180.4、114.、699.2、530.0 μg 的混合對(duì)照品溶液，過(guò)0.22 μm 尼龍微孔濾膜，即得。

2.2 MSPD 法 將狼毒大戟藥材切成小塊干燥至恒定質(zhì)量，用中藥粉碎機(jī)將其粉碎，并過(guò)100目篩。精密稱取0.1 g 藥材粉末和0.3 g 硅膠置于瑪瑙研缽中，充分研磨至樣品與分散劑完全混勻。將分散后的樣品轉(zhuǎn)移至底部鋪有一層脫脂棉的萃取柱中作為固定相，之后在固定相的頂部添加另一層脫脂棉，并用玻璃棒輕壓使固定相壓實(shí)。利用固相萃取裝置減壓洗脫，加入6.0 mL 乙腈，洗脫液收集到10 mL 量瓶中，用乙腈定溶至刻度線。最后，將洗脫液以13 000 r／min 離心5 min，上清液用于色譜分析。

2.3 超聲提取法 精密稱取狼毒大戟粉末1.0 g，置于100 mL 具塞錐形瓶中，精確加入50.0 mL乙腈，稱定錐形瓶的總質(zhì)量。于室溫下超聲（250 W） 提取30 min，提取后使用乙腈補(bǔ)足失質(zhì)量。提取液過(guò)濾，取續(xù)濾液5 mL 置于10 mL 量瓶中，使用乙腈定容至刻度，過(guò)0.22 μm 尼龍微孔濾膜，收集續(xù)濾液進(jìn)行UPLC 分析。

2.4 索氏提取法 精密稱取狼毒大戟粉末1.0 g，使用濾紙密封，放置于索氏提取裝置內(nèi)，圓底燒瓶中加入100 mL 乙腈，用恒溫水浴鍋加熱回流2 h，回流結(jié)束后放冷，過(guò)濾置100 mL 量瓶中，使用乙腈定容至刻度，過(guò)0.22 μm 尼龍微孔濾膜，收集續(xù)濾液進(jìn)行UPLC 分析。

2.5 色譜條件 Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相乙腈（A） -水（B），梯度洗脫（0～1.5 min，45%A；1.5～3 min，45%～65%A；3～7.5 min，65%A；7.5～8 min，65%～45%A；8～10 min，45%A）；體積流量0.4 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量3 μL。

3 結(jié)果與分析

3.1 萃取條件優(yōu)化 作為一種有效的提取方法，MSPD 濃縮了傳統(tǒng)的樣品前處理中所需的樣品均化、組織細(xì)胞裂解、提取、凈化等過(guò)程，避免了樣品均化、沉淀、離心、轉(zhuǎn)移、乳化、濃縮等造成的被測(cè)物的損失［16］。MSPD 萃取過(guò)程的效率和選擇性是由多種因素決定的，在本研究過(guò)程中，為了獲得目標(biāo)成分的最大萃取量，對(duì)影響萃取效率的主要參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，包括分散劑、樣品與分散劑的質(zhì)量比、洗脫溶劑、洗脫溶劑的體積等4個(gè)參數(shù)。

3.1.1 分散劑的影響 分散劑的性質(zhì)是MSPD 過(guò)程中的一個(gè)重要參數(shù)，分散劑對(duì)促進(jìn)溶劑與樣品的相互作用，提高萃取效率和對(duì)目標(biāo)分析物的選擇性起著至關(guān)重要的作用。更重要的是它可以影響洗脫過(guò)程，分散劑不僅作為固定相起到吸附和分離樣品的作用，還作為研磨和混勻材料來(lái)破碎和分散樣品。本研究對(duì)常用的不同性質(zhì)的分散劑硅膠、C18、中性氧化鋁和佛羅里硅土進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖1 顯示，以硅膠和C18為分散劑提取各目標(biāo)化合物的提取率明顯高于中性氧化鋁和佛羅里硅土?？赡苁且?yàn)楣枘z和C18骨架上鍵合了較多的羥基結(jié)構(gòu)，與目標(biāo)化合物分子間形成氫鍵有關(guān)。當(dāng)使用硅膠作為分散劑時(shí)，目標(biāo)成分的萃取率略高于C18，故本實(shí)驗(yàn)采用硅膠為分散劑。

圖1 分散劑對(duì)各成分萃取率的影響Fig.1 Effects of the dispersant on extraction yields of various constituents

3.1.2 樣品與分散劑質(zhì)量比的影響 樣品與分散劑的質(zhì)量比影響目標(biāo)化合物的萃取效率，是MSPD過(guò)程中的另一個(gè)重要參數(shù)，其適當(dāng)?shù)呐浔瓤梢愿淖儤悠放c分散劑的接觸面積。本研究分別考察樣品與硅膠分散劑的1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6等6個(gè)質(zhì)量配比。圖2 顯示，4個(gè)目標(biāo)化合物的萃取率隨著硅膠分散劑的增加而增加，配比為1∶4時(shí)達(dá)到最大值，質(zhì)量比為1∶5 之后萃取率開(kāi)始下降，因此本實(shí)驗(yàn)選擇樣品與硅膠分散劑的質(zhì)量比為1∶4。

圖2 樣品與硅膠的質(zhì)量比對(duì)各成分萃取率的影響Fig.2 Effects of mass ratios of sample to silica on extraction yields of various constituents

3.1.3 洗脫溶劑的影響 在MSPD 過(guò)程中，洗脫溶劑作為流動(dòng)相促進(jìn)目標(biāo)化合物與分散劑相互作用，提高萃取效率，對(duì)提高目標(biāo)分析物的選擇性起著重要作用，適合的洗脫溶劑可以保證從復(fù)雜樣品組分中選擇性地萃取目標(biāo)分析物。本研究考察了石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇和乙醇等不同極性的洗脫溶劑，以篩選出合適的最佳洗脫溶劑。由圖3 可以看出，與其他4 種溶劑相比，乙腈的洗脫效率最高，故本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為洗脫溶劑。

圖3 洗脫溶劑對(duì)各成分萃取率的影響Fig.3 Effects of elution solvents on extraction yields of various constituents

3.1.4 洗脫溶劑體積的影響 充足的洗脫溶劑體積也是本實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，為尋找到完全洗脫各目標(biāo)分析物所需的最小洗脫溶劑用量，本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈的洗脫用量從2.0 mL 到8.0 mL，圖4表明，各目標(biāo)分析物的萃取率在洗脫溶劑用量為6.0 mL 時(shí)已經(jīng)達(dá)到最大值，故本實(shí)驗(yàn)選擇6.0 mL乙腈作為洗脫溶劑體積。

圖4 洗脫溶劑體積對(duì)各成分萃取率的影響Fig.4 Effects of volumes of elution solvent on extraction yields of various constituents

3.2 方法學(xué)考察 在對(duì)MSPD 程序進(jìn)行綜合優(yōu)化后，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，從線性關(guān)系、檢出限、定量限、精密度、穩(wěn)定性及回收率等方面全面驗(yàn)證本研究所建立MSPD-UPLC 方法的各方面性能特點(diǎn)。

3.2.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1” 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液3.00、2.00、1.00、0.50、0.30、0.10 mL，分別置于10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，獲得6 梯度質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別過(guò)0.22 μm 尼龍微孔濾膜，在“2.5” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），混合對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行回歸。檢出限和定量限分別為目標(biāo)分析物的信噪比（S／N）3∶1和10∶1 的質(zhì)量濃度。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2.2 精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn) 取已制得的同一MSPD 樣品，在“2.5” 項(xiàng)色譜條件下，分別于0、2、4、6、8、10 h 進(jìn)樣，測(cè)定日內(nèi)精密度；分別于0、24、48 h 進(jìn)樣，測(cè)定日間精密度。測(cè)得JA、17-JA、JB 及17-JB 的日內(nèi)精密度RSD 分別為1.7%、1.0%、1.3%、1.4%；日間精度RSD 分別為1.1%、1.5%、1.7%、2.0%。表明儀器精密度、樣品穩(wěn)定性良好。

3.2.3 加樣回收率試驗(yàn) 對(duì)樣品中各目標(biāo)分析物的3個(gè)加樣濃度（50%、100%、150%） 的回收率進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表2，得各目標(biāo)分析物的回收率93.0%～94.4%，其RSD 1.3%～1.9%。

3.3 方法比較 為了評(píng)價(jià)本研究所提出的MSPD法的性能，對(duì)優(yōu)化后的MSPD 與索氏提取法、超聲提取法進(jìn)行了比較，見(jiàn)表3，結(jié)果表明，MSPD 法對(duì)各目標(biāo)分析物的提取率高于索氏提取法、超聲提取法。并且MSPD 法在測(cè)定過(guò)程中僅需0.1 g 樣品、6.0 mL 有機(jī)溶劑、15 min 即可完成萃取。因此，與索氏提取法和超聲提取法相比較，MSPD 法在樣品和有機(jī)溶劑的消耗量、環(huán)保、實(shí)驗(yàn)成本、萃取過(guò)程簡(jiǎn)便程度和方法耗時(shí)等多個(gè)方面均具有優(yōu)勢(shì)，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)需加熱，可防止目標(biāo)分析物的降解。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

3.4 樣品分析 為了驗(yàn)證MSPD-UPLC 方法的適用性，按照優(yōu)化后的條件對(duì)不同地區(qū)采集的狼毒大戟樣品（樣品1～3） 中各成分進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表4，色譜圖見(jiàn)圖5 示。結(jié)果表明不同地區(qū)采集的狼毒大戟藥材中各目標(biāo)分析物的含有量有較大差異，不同生長(zhǎng)環(huán)境及生長(zhǎng)年限可能是其含有量差異的主要原因。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表3 方法比較Tab.3 Comparison of methods

圖5 各成分UPLC 色譜圖Fig.5 UPLC chromatograms of various constituents

表4 各樣品分析（μg／g， x±s， n＝3）Tab.4 Analysis of various samples（μg／g， x±s， n＝3）

4 結(jié)論

本研究建立了一種簡(jiǎn)便、有效、快速的MSPD-UPLC 聯(lián)用法同時(shí)提取測(cè)定狼毒大戟中4 種成分的含有量。在3個(gè)實(shí)際樣品的檢測(cè)中驗(yàn)證了該方法用于常規(guī)分析的可行性，取得了較好的效果。該方法可通過(guò)適當(dāng)改變提取條件，以期用于其他藥材中的活性指標(biāo)成分的提取和檢測(cè)。