鐘應(yīng)淮張國松奉建芳程 勐夏明艷劉 夢李東勲劉雪梅*

（1.廣西中醫(yī)藥大學藥學院， 廣西南寧530200； 2.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心， 江西 南昌330006； 3.江西中醫(yī)藥大學， 江西 南昌330006）

茶芎Lgusticum sinenseOliv.cv.Chaxiong 又名撫芎，系傘形科藁本屬植物，其根莖是江西特產(chǎn)中藥材之一，主產(chǎn)于江西省九江地區(qū)的瑞昌、武寧、德安等地［1］。其性溫、味辛，歸肝、膽、心包經(jīng)等，具有行氣活血、祛風止痛之功效，臨床上有時與川芎混用，且在1996 年首次被列入《江西省中藥材標準》［2-3］。藥理實驗表明，茶芎揮發(fā)油對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、子宮平滑肌等均有明顯的生理活性，還具有增強免疫力和鎮(zhèn)痛作用，且毒性較低［4-5］。

近年來關(guān)于其化學成分、藥理作用和制劑工藝的研究一直偏少。本課題組目前對茶芎的化學成分進行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)其中含有大量的苯酞類化合物，這些化合物主要分為苯酞單體（主要存在于揮發(fā)油中） 和苯酞二聚體（主要存在于重組分中），其中苯酞單體有正丁基苯酞，Z-藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞、新蛇床內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、senkyunolide F、senkyunolide B 等28個化合物；苯酞二聚體有歐當歸內(nèi)酯A、tokinolide B、（Z） -6，8′-7，3′-二聚藁本內(nèi)酯等［6-8］。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，茶芎中的苯酞類成分可以增強冠脈血流量、舒張血管，可用于抗血栓以及改善局部腦缺血引起的腦水腫［9-12］。課題組將采自江西省德安縣的新鮮茶芎根莖在常溫下陰干、粉碎，結(jié)合95%乙醇提取與乙酸乙酯萃取即可得到苯酞類成分的粗提物，再利用特殊的液-液分離技術(shù)POPE 分子精餾，依靠不同物質(zhì)分子運動平均自由程的差別從而實現(xiàn)不同成分的分離，最終得到純度在90% 以上的茶芎苯酞類有效部位（Phthalide target areas of Chaxiong，CPTA）［13］。經(jīng) 過13CNMR、1H-NMR 和MS 的鑒定，CPTA 中已較為明確的5 種成分分別為洋川芎內(nèi)酯A、Z-藁本內(nèi)酯、正丁基苯酞、新蛇床內(nèi)酯和丁烯基苯酞。本實驗采用HPLC 法同時測定CPTA 中5 種成分的含有量，以期為茶芎苯酞類有效部位的質(zhì)量控制提供參考，同時，也為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT 高效液相色譜儀（配備SPDM20 A型PDA 紫外檢測器，SIL-20A 自動進樣器，CTO-20AC 柱溫箱，Labsolutions 工作站）、UV-2550 紫外可見分光光度計（日本Shimadzu 公司）；MS 105 DU型電子天平（瑞士Mettler toledo 公司）；BSA2202S型電子天平（德國Sartorius 公司）；BCD-239 K 電冰箱（海爾集團）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHZ-82A 氣浴恒溫振蕩器（金壇區(qū)白塔新寶儀器廠）；SMART超純水系統(tǒng)（力康生物醫(yī)療科技控股集團）。

1.2 試劑與藥物洋川芎內(nèi)酯 A（批號DST180508-008，純度98.84%）、正丁基苯酞（批號DST180717-002，純度98.44%）、Z-藁本內(nèi)酯（批號DST180815-007，純度98.93%） 均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；新蛇床內(nèi)酯（批號CHB1810707，純度98.48%）、丁烯基苯酞（批號CHB170305，純度＞98.0%） 均購自成都克洛瑪生物科技有限公司；CPTA（批號170713、170918、170920、180106、180107）；所用甲酸、乙酸和磷酸皆為分析純、甲醇、乙腈為色譜純，均由西隴科學股份有限公司生產(chǎn)，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備 新鮮茶芎根莖50 kg，室溫下陰干，取其中10 kg 粉碎，過20目篩，6 倍量95%乙醇回流提取2 次，每次1.5 h。合并濾液，減壓濃縮得到稠浸膏，將稠浸膏分散于2 L 水中，充分混勻后用乙酸乙酯萃取，減壓回收溶劑得到乙酸乙酯萃取部位。最后將該萃取部位采用POPE 分子精餾，可得輕組分和重組分，輕組分即為CPTA，得率為0.93%。

2.2 色譜條件 AkzoNobel Kromasil? 100-5-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相水（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，38%～42% B；10～36 min，42%～45% B；36～55 min，45%～48% B；55～60 min，48%～38%B）；檢測波長280、230 nm（在280 nm 波長下檢測洋川芎內(nèi)酯A 和Z-藁本內(nèi)酯，在230 nm 波長下檢測正丁基苯酞、新蛇床內(nèi)酯與丁烯基苯酞）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30℃；進樣量20 μL。

2.3 溶液配制

2.3.1 混合對照品溶液 精密稱取對照品洋川芎內(nèi)酯A 22.87 mg、正丁基苯酞10.41 mg、Z-藁本內(nèi)酯36.58 mg、新蛇床內(nèi)酯10.56 mg、丁烯基苯酞11.39 mg，分別置于25 mL 棕色量瓶中，甲醇溶解并定容，搖勻，即得相應(yīng)對照品貯備液。分別精密吸取8、1、6、8、1 mL 于25 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻即得。

2.3.2 供試品溶液 將CPTA 放置于氣浴恒溫振蕩器中，40℃微熱使其呈均一透明狀。稱取CPTA約200 mg，置50 mL 棕色量瓶中，加入適量甲醇并超聲5 min（250 W，40 kHz） 使其溶解。取出，甲醇定容至刻度，搖勻，得溶液。從該溶液中精密吸取2 mL 置25 mL 棕色量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 陰性對照溶液 陰性對照溶液為純甲醇溶液，取適量過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性與專屬性試驗 取“2.3” 項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，在“2.2” 色譜條件下進樣。由圖1 可知，對照品溶液和供試品溶液在圖譜相同位置處有對應(yīng)的吸收峰，各峰間分離度皆大于 1.5，對稱因子0.95～1.05，各成分主峰理論塔板數(shù)皆大于5 000，且陰性對照溶液在相同位置并無干擾，表明方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 線性關(guān)系考察取“2.3.1” 項下混合對照品溶液適量，分別稀釋至2、4、8、10、16倍，即得一系列梯度的混合對照品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進樣。以質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸，結(jié)果見表1，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6 精密度試驗 精密吸取“2.3.1” 項下混合對照品溶液20 μL，在“2.2” 項色譜條件下連續(xù)進樣6 針，測得洋川芎內(nèi)酯A、正丁基苯酞、新蛇床內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯和丁烯基苯酞的峰面積RSD分別為0.46%、0.71%、0.41%、0.71%、0.84%，表明儀器精密度良好。

選取我院2016年1月～2018年6月老干部病房收治的100例患者分為優(yōu)質(zhì)護理組及護理風險評估干預(yù)組兩組。優(yōu)質(zhì)護理組50例，男34例，女16例；年齡77～87歲，平均（63.27±2.85）歲。護理風險評估干預(yù)組50例，男35例，女15例；年齡76～88歲，平均（63.42±2.96）歲。組間性別、年齡等一般資料作比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批CPTA 樣品（批號170713） 6 份，每份約200 mg，精密稱定，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進樣，測得洋川芎內(nèi)酯A、正丁基苯酞、新蛇床內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞的平均含有量分別 為 33.77%、1.37%、16.52%、37.98%、2.43%，RSD 分別為1.48%、1.60%、1.39%、1.43%、1.35%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取CPTA 樣品（批號170713）1 份，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、12、18、24、36 h后，在“2.2” 項色譜條件下進樣，測得洋川芎內(nèi)酯A、正丁基苯酞、新蛇床內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞的峰面積RSD 分別為0.73%、0.84%、0.75%、0.69%、1.07%，表明供試品溶液在室溫條件下36 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知準確含有量的CPTA 樣品適量，共9 份，分別配制低、中、高3 種不同濃度的樣品，每種3 份。1～3 號樣品中對照品與供試品溶液的加入體積比例為0.5∶1，4～6號樣品中對照品與供試品的加入體積比例為1∶1，7～9 號樣品二者的加入體積比例控制為1.5∶1，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（%， n＝9）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（%， n＝9）

2.10 樣品含有量測定 取5 批CPTA 樣品（批號分別是 170713、170918、170920、180106 和180107），各3 份，精密稱定，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進樣，計算各成分的含有量和RSD，見表3。

3 討論

3.1 檢測波長 將洋川芎內(nèi)酯A、正丁基苯酞、Z-藁本內(nèi)酯、新蛇床內(nèi)酯和丁烯基苯酞對照品稀釋至合適濃度，在190～800 nm 范圍內(nèi)進行全波長掃描，結(jié)果顯示，洋川芎內(nèi)酯A 在278 nm 處有最大吸收峰，Z-藁本內(nèi)酯在282、294、323 nm 處均有吸收峰，且3個吸收峰都較為強烈；正丁基苯酞在227、274、80 nm 處均有吸收峰，但274、280 nm處的吸收峰較??；新蛇床內(nèi)酯在218 nm 處有較為強烈的吸收峰，但當檢測波長大于250 nm 時完全沒有紫外吸收，因此其最佳檢測波長范圍為215～235 nm；丁烯基苯酞在216、235、260、312 nm 處均有吸收峰，但312 nm 的吸收值較小。

表3 各成分含有量測定結(jié)果（%， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（%， n＝3）

3.2 色譜柱 實驗前期考察了Hypersil ODS2 C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Hypersil BDS2 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 對樣品中5 種成分的分離效果，因新蛇床內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯和丁烯基苯酞3 種成分的極性極為接近，前3 種色譜柱對其分離效果不佳，只有Kromasil 100-5-C18柱實現(xiàn)了5 種成分的分離，相鄰各主峰間分離度大于1.5，且基線平穩(wěn)，峰形較好，因此采用Kromasil 100-5-C18柱。

3.3 流動相 課題組嘗試了甲醇-乙腈1∶1-水、甲醇-乙腈3∶1-水、甲醇-乙腈1∶3-水等一系列的混合系統(tǒng)［15-16］，結(jié)果顯示，使用前二者，新蛇床內(nèi)酯與丁烯基苯酞峰形重合，使用甲醇-乙腈1∶3-水混合系統(tǒng)時，Z-藁本內(nèi)酯與新蛇床內(nèi)酯峰形重合，完全不能實現(xiàn)新蛇床內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯和丁烯基苯酞3 種成分的分離，因此混合系統(tǒng)不宜采用。此外，為了減輕峰形拖尾，課題組研究了在乙腈-水系統(tǒng)情況下，在水相中加入0.1%甲酸、0.1%乙酸、0.1%磷酸等有機酸，但最后發(fā)現(xiàn)酸的加入在230 nm 波長處溶劑峰吸收較大，且基線漂移嚴重，對樣品的輕度拖尾并無明顯改善，因此水系中不宜加入有機酸等。綜合以上研究，流動相乙腈-水能實現(xiàn)樣品中5 種物質(zhì)的分離，峰形只有輕度拖尾。

3.4 柱溫與體積流量 考察了25、30、35、40℃對出峰時間和峰形的影響。結(jié)果顯示，25、30℃柱溫時峰形較好，各峰分離度均能達到要求；35、40℃時出峰雖快，但新蛇床內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯和丁烯基苯酞不能實現(xiàn)較好的分離，考慮到25℃柱溫有時較難恒定，因此選擇30℃。

本研究考察了0.8、1.0、1.2 mL／min 3 種不同體積流量對峰形與出峰的影響，0.8 mL／min 時出峰時間明顯減慢，且樣品中的新蛇床內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞分離度不符合要求；1.0、1.2 mL／min 時峰形相差不大，各峰也能明顯分開，但1.2 mL／min 時系統(tǒng)壓力偏高，為延長液相使用壽命和保護色譜柱，最終選擇1.0 mL／min。

3.5 其他 樣品測定中，180107 批樣品5 種成分的含有量皆比前4 批偏高，這可能是不同批次的藥材由于生長環(huán)境不同、在采收或加工過程的差異所造成的［17］。因此，原料藥材應(yīng)從來源控制，建立并健全多指標成分評價茶芎苯酞類有效部位質(zhì)量的方法［18］，以期為后續(xù)制劑研究提供質(zhì)量保證。

在實驗過程中，對照品Z-藁本內(nèi)酯配制成貯備液（約1.3 mg／mL） 后，即便在4～8℃下低溫保存也不穩(wěn)定，容易發(fā)生降解并產(chǎn)生大量雜質(zhì)，因此應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，或者在-20℃低溫環(huán)境下保存。