殷 紫 張二飛 鄧祥敏 張建華 季潤(rùn)元 韓永紅 齊 越

（1.江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院 檢驗(yàn)藥學(xué)系 江蘇 淮安223001； 2.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院 江蘇 淮安223001；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 遼寧 沈陽(yáng)110034）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD） 是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，病理特征在于細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)，細(xì)胞外淀粉樣蛋白斑塊沉積和神經(jīng)元丟失，以及諸如學(xué)習(xí)、記憶障礙等。越來(lái)越多的研究表明，β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ） 沉積是AD 發(fā)病機(jī)制中最早和最重要的事件，并且在疾病的發(fā)展中其表達(dá)不斷增加［1-2］，tau 蛋白的磷酸化，可加速AD 腦內(nèi)Aβ 的沉積［3］，因此，抑制Aβ 沉積和tau 蛋白磷酸化，將有易于AD 的治療。醒腦益智湯是遼寧省中醫(yī)研究院的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有健脾益腎填精、除痰、化痰之功效，臨床應(yīng)用療效較好，但具體作用機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)以AD 模型小鼠為研究對(duì)象，從Aβ 沉積和tau 蛋白磷酸化2個(gè)方面，考察醒腦益智湯對(duì)AD的治療作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)ICR 雄性小鼠，8 周齡，體質(zhì)量（20±2） g，總共114 只，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（遼） 2010-0001，在遼寧中醫(yī)藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，使用許可證號(hào)SYXK（遼） 2010-0003。

1.2 藥物與試劑 醒腦益智湯主要由茯苓、人參、知母、菖蒲、牛膝等組成，用10 倍量的水浸泡400 g 藥材30 min，煮沸，用文火煎煮藥材45 min；過(guò)濾出湯藥，剩余藥渣加入8 倍量水，沸騰，用文火煎煮20 min，過(guò)濾出湯藥，將2 次藥液合并，即得1.02 g 生藥／mL 藥液。Aβ1-42試劑盒（小鼠，貨號(hào)842401，美國(guó)Cusabio 公司）；Aβ1-40試劑盒（小鼠，貨號(hào)842301，美國(guó)Cusabio 公司）；Aβ25-35（批號(hào)A4559，美國(guó)Sigma 公司）；硫黃素S 染色（批號(hào)T1892，美國(guó)Sigma 公司）；鹽酸多奈哌齊片［批號(hào)B14202012042，規(guī)格10 mg／片，衛(wèi)材（中國(guó)） 藥業(yè)有限公司提供］；腦啡肽酶（NEP，批號(hào)bs-11102R，美 國(guó)Bioss 公 司）；Phospho-Tau（Ser 202，批號(hào) MN1020，美 國(guó) Invitrogen 公 司）；Phospho-Tau（Thr 231，批號(hào)701056，美國(guó)Invitrogen公司）；p-PI3K（批號(hào)4228p，美國(guó)Cell Signaling 公司）；PI3K（批號(hào)bs-6423R，美國(guó)Bioss 公司）；胰島素降解酶（IDE，批號(hào) 21728-1-AP，美 國(guó)Proteintech 公司）；β-actin（批號(hào)sc-47778，美國(guó)Santa Cruz 公司）；Akt（批號(hào)sc-1619，美國(guó)Santa Cruz 公司）；p-Akt（批號(hào)sc-7985，美國(guó)Santa Cruz公司）。

1.3 儀器 Western blot 電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；DW-200型腦立體定位儀（成都泰盟科技公司）；Azure AO型酶標(biāo)儀（美國(guó)Azure 公司）。

2 方法

2.1 造模及給藥 按體質(zhì)量將114 只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、醒腦益智湯組（18 g 生藥／kg）、醒腦益智湯組（9 g 生藥／kg）、醒腦益智湯組（4.5 g 生藥／kg）、多奈哌齊組（1.3 mg／kg），每組19 只。手術(shù)前腹腔注射水合氯醛（300 mg／kg），剃去頭部毛發(fā)，用碘酒或酒精消毒，置腦立體定位儀。沿顱骨中線(xiàn)切開(kāi)頭部皮膚約2 cm，囟門(mén)為零點(diǎn)，旁開(kāi)1.0 mm，向后0.5 mm，深度為3.0 mm，3 min 內(nèi)將3 μL 老化（用無(wú)菌的生理鹽水溶解Aβ25-35，放于37 °C 培養(yǎng)箱，孵育120 h） Aβ25-35緩緩注射入側(cè)腦室，留針5 min。假手術(shù)組小鼠注入生理鹽水。第2 天，按灌胃給藥（20 mL／kg），連續(xù)灌胃28 d。同時(shí)假手術(shù)組和模型組給予蒸餾水。

2.2 Morris 水迷宮檢測(cè) 第23 天給藥1 h 后進(jìn)行Morris 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)。此裝置直徑80 cm，高33 cm，頂部開(kāi)口鐵桶。底面標(biāo)記四個(gè)象限（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），把平臺(tái)設(shè)置于Ⅰ象限，且低水平面1 cm，水溫25℃左右。實(shí)驗(yàn)時(shí)把小鼠從入水到登錄平臺(tái)的時(shí)間，作為潛伏期。不能登陸的進(jìn)行訓(xùn)練直到找到平臺(tái)，停留10 s。間隔時(shí)間為4 h，2 次／d，連續(xù)5 d。

2.3 硫黃素S 染色 給藥結(jié)束，每組隨機(jī)取6 只小鼠，腹腔注射水合氯醛，用輸液針從心尖刺入左心室，同時(shí)右心耳剪一小口，生理鹽水灌注（預(yù)冷），使右心房流出液體，接著灌注4% 多聚甲醛（預(yù)冷），直到四肢抽搐、尾巴僵硬，肝臟發(fā)白時(shí)，取腦。將大腦放于4% 多聚甲醛，制成石蠟切片，脫水，PBS 洗滌3 次，3 min／次，滴加過(guò)氧化酶阻斷劑，室溫孵育10 min，PBS 洗 滌3 次，用0.012 5%硫黃素S 乙醇溶液避光孵育10 min，PBS清洗3 次，封片，熒光觀察。

2.4 ELISA 法檢測(cè)海馬內(nèi)可溶性及難溶性Aβ 給藥結(jié)束后1 h，取各組8 只小鼠的海馬組織，加裂解液，勻漿10 s，重復(fù)5 次，隔30 s 一次，離心5 min（20 000 r／min），取上清，檢測(cè)可溶性待測(cè)物質(zhì)；沉淀物加入70% 蟻酸，勻漿（冰上）；離心5 min（44 000 r／min），用1 mol／L Tris 中和上清，分裝，檢測(cè)非可溶性待測(cè)成分。依據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行測(cè)定。

2.5 Western blot 檢測(cè)海馬組織相關(guān)蛋白表達(dá) 給藥結(jié)束后，每組取5 只小鼠的海馬。提取總蛋白，BSA 法測(cè)定蛋白濃度。電泳（8%～12% 的凝膠、100 mA、2 h） 轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加一抗（Ser 202、Thr 231、NEP、IDE、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt），4℃孵育過(guò)夜。TBST 洗滌3次，10 min／次，二抗孵育，TBST 洗 滌3 次，10 min／次，加入特超敏ECL 化學(xué)發(fā)光液，用凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白表達(dá)。采用ImageJ 圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，將模型組或假手術(shù)組灰度值設(shè)置1，其余各組按照對(duì)應(yīng)的比率得到相應(yīng)的灰度值，組間比較，進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 醒腦益智湯對(duì)AD 模型小鼠Morris 水迷宮的影響 與假手術(shù)組比較，第3～5 天模型組小鼠游泳潛伏期延長(zhǎng)（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，第4、5 天醒腦益智湯（18、9 g 生藥／kg） 及鹽酸多奈哌齊可縮短游泳潛伏期（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 醒腦益智湯對(duì)AD 模型小鼠游泳潛伏期的影響（n ＝19）Fig.1 Effects of XNYZD on latent time in AD mouse models（n＝19）

3.2 醒腦益智湯對(duì)AD 模型小鼠可溶性及難溶性Aβ1-40及Aβ1-42水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組可溶性與難溶性Aβ1-42、Aβ1-40水平增加（P＜0.05）；與模型組比較，醒腦益智湯（18、9 g 生藥／kg） 及鹽酸多奈派齊可減少可溶性與難溶性Aβ1-42、Aβ1-40水平（P＜0.05，P＜0.01），醒腦益智湯（4.5 g 生藥／kg組） 可降低難溶性Aβ1-40、Aβ1-42水平（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表1。說(shuō)明醒腦益智湯具有降低Aβ 水平的作用。

3.3 醒腦益智湯對(duì)Aβ 表達(dá)的影響 硫黃素S 染色結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組Aβ 表達(dá)增加，與模型組比較，醒腦益智湯可降低腦組織內(nèi)Aβ 表達(dá)，見(jiàn)圖2。

表1 醒腦益智湯對(duì)AD 模型小鼠可溶性及難溶性Aβ1-40及Aβ1-42表達(dá)的影響（pg／mg， x±s， n＝8）Tab.1 Effects of XNYZD on soluble and insoluble Aβ1-40 and Aβ1-42 expression in AD mouse models（pg／mg，，n＝8）

表1 醒腦益智湯對(duì)AD 模型小鼠可溶性及難溶性Aβ1-40及Aβ1-42表達(dá)的影響（pg／mg， x±s， n＝8）Tab.1 Effects of XNYZD on soluble and insoluble Aβ1-40 and Aβ1-42 expression in AD mouse models（pg／mg，，n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖2 醒腦益智湯對(duì)Aβ 表達(dá)的影響Fig.2 Effects of XNYZD on Aβ expression in AD mouse models

3.4 醒腦益智湯對(duì)AD 模型小鼠海馬組織相關(guān)蛋白的影響 與假手術(shù)組相比，模型組tau 蛋白化點(diǎn)（Ser 202，Thr 231） 表達(dá)增加，p-PI3K、p-Akt、NEP 及IDE 表達(dá)減少（P＜0.05）；與模型組相比，醒腦益智湯（18 g 生藥／kg） 可減少tau 蛋白化點(diǎn)（Ser 202，Thr 231） 表達(dá)，增加p-PI3K、p-Akt、NEP 及IDE 表達(dá)（P＜0.05），醒腦益智湯（9 g 生藥／kg） 可降低tau 蛋白化點(diǎn)（Ser 202，Thr 231）表達(dá)，增加IDE 表達(dá)（P＜0.05）；醒腦益智湯（4.5 g 生藥／kg） 可降低Thr 231 表達(dá)，增加IDE表達(dá)（P＜0.05）；鹽酸多奈派齊可減少tau 蛋白化點(diǎn)（Ser 202，Thr 231） 表達(dá)，增加p-Akt 及IDE表達(dá)，見(jiàn)圖3、表2。

圖3 Western blot 檢測(cè)各組小鼠海馬組織相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of related proteins in mouse hippocampus by Western blot

表2 醒腦益智湯對(duì)AD 模型小鼠海馬組織相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（， n＝5）Tab.2 Effects of XNYZD on protein expression in hippocampal tissue of AD mouse models（， n＝5）

表2 醒腦益智湯對(duì)AD 模型小鼠海馬組織相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（， n＝5）Tab.2 Effects of XNYZD on protein expression in hippocampal tissue of AD mouse models（， n＝5）

注：與假手術(shù)組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

4 討論

AD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前研究多集中在tau 蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)及Aβ 異常導(dǎo)致的細(xì)胞死亡［3］，兩者多存在于大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)，與癡呆有關(guān)［4］。

tau 蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，在人體內(nèi)由于其mRNA 剪輯方式不同，存在著6 種不同的同功異構(gòu)體［5］，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元內(nèi)，具有維持細(xì)胞骨架完整性、神經(jīng)突起的形成及軸突運(yùn)輸?shù)淖饔?。AD 時(shí)，tau 蛋白發(fā)生異常磷酸化，過(guò)度磷酸化的tau 蛋白則喪失了微管結(jié)合能力，易聚集，形成難溶的螺旋狀細(xì)絲，導(dǎo)致神經(jīng)元纖維纏結(jié)，細(xì)胞骨架異常及細(xì)胞死亡［6］。tau 蛋白的磷酸化位點(diǎn)主要為絲氨酸（Ser） 和蘇氨酸（Thr） 殘基。在本研究中，采用Western blot 法對(duì)Ser 202 及Thr 231 位點(diǎn)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，醒腦益智湯可降低Ser 202 及Thr 231 磷酸化位點(diǎn)的表達(dá)。

Aβ 是由淀粉樣前體蛋白經(jīng)過(guò)β、γ 水解酶分解得到的，主要包括Aβ1-40和Aβ1-42［7］。AD 患者中，APP 經(jīng)β 途徑代謝增多，產(chǎn)生較多的Aβ1-40和Aβ1-42，沉積于腦組織中［8］。本研究中，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦內(nèi)的Aβ1-40和Aβ1-42顯著增加，與相關(guān)報(bào)道一致［9-11］。醒腦益智湯可降低其增加。Aβ 清除機(jī)制主要包括蛋白酶體系統(tǒng)，小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用，以及血液循環(huán)清除方式。其中細(xì)胞外Aβ 降解酶包括NEP、IDE、基質(zhì)金屬蛋白酶、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶和纖溶酶等。研究最廣泛的酶是NEP、IDE。NEP 為體外降解Aβ最有效的水解酶。研究表明，NEP 缺乏會(huì)導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ 沉積［12］。APP 轉(zhuǎn)基因小鼠中，NEP的長(zhǎng)期基因治療可降低Aβ 水平［13］。IDE 可以降解細(xì)胞外Aβ，其表達(dá)會(huì)隨著年齡增加而下降［14］。本研究中，與假手術(shù)比較，模型組的NEP、IDE 表達(dá)降低，醒腦益智湯可增加NEP 及IDE 的表達(dá)。

PI3K／Akt 信號(hào)通路是細(xì)胞增殖，分化，凋亡和衰老的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子?；罨腁kt 可通過(guò)調(diào)節(jié)CREB 和抑制線(xiàn)粒體相關(guān)因子（主要是細(xì)胞色素C和AIF） 的釋放來(lái)調(diào)節(jié)Bcl-2 啟動(dòng)子的活性，從而抑制細(xì)胞凋亡［15］。PI3K／Akt 通路的激活與突觸形成有關(guān)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明PI3K／Akt 的活化可阻止Aβ 聚集及tau 蛋白磷酸化誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性［16-17］?？梢?jiàn)，通過(guò)調(diào)控PI3K／Akt 信號(hào)通路的活性可以影響細(xì)胞的凋亡，最終達(dá)到改善記憶功能減退的目的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，醒腦益智湯可增加PI3K 和Akt 磷酸化表達(dá)水平，促進(jìn)其活化。這些結(jié)果均提示醒腦益智湯可通過(guò)PI3K／Akt 途徑減少Aβ 聚集及Tau 蛋白磷酸化。

綜上所述，醒腦益智湯可升高腦內(nèi)的降解酶，增加Aβ 清除，同時(shí)減少Ser 202 及Thr 231 位點(diǎn)的磷酸化，其作用機(jī)制可能與PI3K／Akt 信號(hào)通路有關(guān)。