劉 星 李麗娟 彭莉萍 魏妮娜 劉銀花 許佳偉 黎善銘

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)， 廣東 珠海519041； 2.香洲區(qū)人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 廣東 珠海519040）

隨著預(yù)期壽命的延長和生活方式的改變，老年性疾病患病率不斷增加，尤其是以認知功能減退為主的腦部退行性疾病成為影響老年人健康的主要疾病，是威脅老年人健康的“四大殺手” 之一，并已成為威脅人類健康的最嚴重疾病之一［1］。尋找一種有效減緩其發(fā)展的治療方法，延緩腦衰老、減輕記憶減退和認知障礙等是全球亟待解決的問題，也是老年醫(yī)學(xué)研究的熱點之一。神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs） 為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的原始細胞，具有自我更新、多向分化、遷移的潛能，可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞［2］。神經(jīng)干細胞移植治療為神經(jīng)再生的治療策略開辟了嶄新的研究方向，被譽為目前神經(jīng)系統(tǒng)損傷最有潛力的治療方式，并在臨床應(yīng)用中取得了一定療效［3］。

川續(xù)斷皂苷Ⅵ（Asperosaponin Ⅵ） 又名木通皂苷D，是從傳統(tǒng)中草藥川續(xù)斷植物的根中提取分離出的三萜皂苷類化合物，為川續(xù)斷的主要活性成分。川續(xù)斷皂苷Ⅵ在神經(jīng)保護、抗細胞凋亡、心肌保護、鎮(zhèn)痛等方面的發(fā)揮作用，引起廣大學(xué)者的關(guān)注［4］。川續(xù)斷皂苷Ⅵ神經(jīng)保護效應(yīng)的研究皆與阿爾茲海默?。ˋlzheimer’ disease，AD） 有關(guān)。研究表明，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可以顯著抑制Aβ 誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的激活，減少膠質(zhì)細胞釋放細胞因子和炎癥因子，有效降低AD 發(fā)?。?］。川續(xù)斷皂苷Ⅵ神經(jīng)保護機制與其抑制神經(jīng)細胞凋亡、炎癥反應(yīng)的發(fā)生以及氧化應(yīng)激有關(guān)［6］。川續(xù)斷皂苷VI 與人參總皂苷具有類似的藥理活性，研究顯示人參皂苷對NSCs 增殖和分化具有促進作用［7］。同時鑒于川續(xù)斷皂苷VI 具有神經(jīng)保護作用，本研究探討川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對神經(jīng)干細胞的增殖和分化的影響。

1 材料

1.1 動物 SPF 級昆明種小鼠，體質(zhì)量（20±2） g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（粵） 2013-0002。動物飼料購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為溫度25～28℃，相對濕度70%～85%，自然通風(fēng)，光照／黑暗各12 h。

1.2 藥物與試劑 川續(xù)斷皂苷Ⅵ（批號111685-201605） 購自廣州永凱生物科技有限公司；CCK-8試劑（批號160816） 購自廣州速研生物科技有限公 司；B27（批號 1678168 ）、EGF（批號1680430）、DMEM／F12（批號1672580） 購自美國Gibco 公 司；FITC-羊抗兔IgG（批號L147A）、TRITC-羊抗小鼠IgG（批號L146A） 購自美國Gene Copoeia 公司；Nestin 單克隆抗體（批號2370145）、Tubulin 單克隆抗體（批號2468132） 購自美國Santa Cruz 公 司；GFAP 多克隆抗體（批號A0237）、BrdU 單克隆抗體（批號A1482）、Actin多克隆抗體（批號A2319）、caspase-3 多克隆抗體（批號A19654）、Jagged 1 多克隆抗體（批號A12754） 購自美國ABclonal 公司；TRIzol（批號1712036）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號1711282） 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京） 有限公司；SYBR master mix（批號1801275） 購自諾唯贊生物有限公司。

2 方法

2.1 含藥血清制備 稱取100 mg 川續(xù)斷皂苷Ⅵ溶于50 mL 超純水，使終質(zhì)量濃度為2 mg／mL。給藥組小鼠腹腔注射川續(xù)斷皂苷Ⅵ（10 mL／kg），空白對照組小鼠則腹腔注射超純水，連續(xù)給藥7 d，末次給藥1 h 后摘眼球取血，4℃靜置1～2 h，3 000 r／min離心15 min，取上清用0.22 μm 無菌濾膜過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆?。給藥組所得的血清為高濃度含藥血清，分別稀釋1、2 倍為中、低濃度含藥血清，空白對照組取得的血清為空白血清。

2.2 神經(jīng)干細胞分離與培養(yǎng) 選取13～15 d 孕齡小鼠（SPF 級昆明種小鼠），頸椎脫臼法處死小鼠，酒精消毒剖開腹腔取出胚胎。在D-Hank’s 溶液中剝離胎盤、胎膜，并用D-Hank’s 漂洗4 次。用手術(shù)刀切取前腦側(cè)腦室周圍組織（包含腦室下區(qū)） 于培養(yǎng)皿內(nèi)，加入2 mL 培養(yǎng)基（1% 雙抗、1%B27、0.02%EGF、DMEM 培養(yǎng)基） 吹打制成細胞懸液，400目篩網(wǎng)過濾，1 000 r／min 離心5 min，棄上清加入培養(yǎng)基重懸細胞。接種于培養(yǎng)板內(nèi)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細胞生長情況。

2.3 神經(jīng)干細胞的鑒定、分化、凋亡 取無菌蓋玻片，置于多聚賴氨酸中避光包被24 h。使用前用滅菌PBS 漂洗3 次，5 min／次，晾干，平鋪于6 孔板內(nèi)。取神經(jīng)干細胞懸液滴加在蓋玻片上靜置2 h，分別加入含有10%含藥血清（高、中、低濃度）、空白血清培養(yǎng)基1 mL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。棄除培養(yǎng)基，PBS 漂洗3 次，滴加預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液固定15 min，PBS 漂洗。0.5%Triton X-100 室溫通透20 min，PBS 漂洗。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBS 漂洗。滴加一抗（Nestin、BrdU、Tublin 按1∶500 稀釋，GFAP 按1∶200 稀釋），4℃過夜，PBS 漂洗3 次。滴加FITC 或TRITC 標記的二抗（1∶200） 室溫孵育30 min，PBS 洗3 次。滴加DAPI 染核15 min，PBS 漂洗，熒光顯微鏡下觀察［8］。

2.4 CCK-8 法檢測神經(jīng)干細胞增殖 取神經(jīng)干細胞懸液加入96 孔細胞培養(yǎng)板中，分別加入含有10%含藥血清（高、中、低濃度）、空白血清培養(yǎng)基200 μL，培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入10 μL CCK-8 試劑培養(yǎng)4 h，取出輕微振蕩混勻后，酶標儀檢測450 nm 處OD。

2.5 RT-PCR 檢測基因表達 加入含有10%含藥血清（高、中、低濃度）、空白血清培養(yǎng)基處理神經(jīng)干細胞72 h，收集細胞。參照TRIzol RNA 試劑盒說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用ABI 7500 熒光實時定量PCR 儀檢測基因的相對表達量。擴增程序為95 °C 預(yù)變性30 s；95 °C 變性5 s，60 °C 退火延伸34 s，40個循環(huán)。以Actin作為內(nèi)參，利用2-ΔΔct方法分析基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tabl.1 Primer sequences

2.6 Western blot 檢測蛋白表達 加入含有10%含藥血清（高、中、低濃度）、空白血清培養(yǎng)基處理神經(jīng)干細胞72 h，收集細胞。提取總蛋白，用BCA 法測定樣品蛋白濃度，按50 μg 總蛋白量計算上樣體積。100℃變性10 min，12% SDS-PAGE 電泳1.5 h，250 mA 轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗（Actin、caspase-3、Tublin 按1∶1 000稀釋，Jagged1、GFAP 按1∶500 稀釋）4℃過夜，TBST 漂洗后室溫孵育二抗（1∶10 000）1 h。TBST 再次漂洗后，滴加ECL 超敏發(fā)光液至PVDF 膜上，采用天根成像儀曝光。以Actin 為內(nèi)參，計算目的蛋白灰度值，并將空白對照組目的蛋白灰度值比定為1，計算實驗組中各蛋白的相對表達量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)干細胞鑒定 初期原代神經(jīng)干細胞呈單個懸浮狀，表面圓潤光滑，透光性強；培養(yǎng)24 h后細胞開始聚集成團；72 h 可見神經(jīng)球形成，立體感和折光性強，表面光滑、透亮，表明干細胞活力良好。經(jīng)免疫熒光法鑒定，Nestin 染色陽性細胞呈綠色熒光，DAPI 染色后細胞核呈藍色熒光。見圖1。經(jīng)統(tǒng)計神經(jīng)干細胞比例達95%以上，表明該培養(yǎng)體系可用于后續(xù)實驗研究。

圖1 NSCs 鑒定（×200）Fig.1 NSCs identification（×200）

3.2 川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對神經(jīng)干細胞增殖影響 不同濃度含藥血清OD450nm與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。DAPI 核染細胞呈橢圓形，均勻分布。Brdu 陽性細胞數(shù)量較少，占總細胞數(shù)比例低。與空白對照組相比，不同濃度含藥血清Brdu 陽性細胞數(shù)量百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3，與CCK-8 檢測結(jié)果一致。說明川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對神經(jīng)干細胞增殖無作用。

圖2 MTT 檢測各組神經(jīng)干細胞增殖Fig.2 NSCs proliferation in each group by MTT

圖3 Brdu 檢測各組神經(jīng)干細胞增殖Fig.3 NSCs proliferation in each group by Brdu

3.3 川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對神經(jīng)干細胞分化的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示，神經(jīng)元胞體呈橢圓形或梭形，細胞體積縮小向核靠攏，突起呈雙極或多級狀，細長的突起交織成網(wǎng)?？瞻讓φ战M神經(jīng)元數(shù)量較少，趨向于分化為星形膠質(zhì)細胞。不同濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清均能促進NSCs 分化，且主要向神經(jīng)元方向分化。與空白對照組相比，川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清高、中濃度組的神經(jīng)元分化率更高（P＜0.05），見圖4。

3.4 川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對神經(jīng)干細胞凋亡的影響 經(jīng)DAPI 染色后，凋亡的神經(jīng)干細胞體積縮小，與周圍的細胞脫離，細胞質(zhì)密度增加，通透性改變，核質(zhì)濃縮，胞質(zhì)明亮。與空白對照組相比，川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清高濃度組細胞凋亡率更高（P＜0.05），而低、中濃度組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。說明川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清高濃度可誘導(dǎo)細胞凋亡，低、中濃度含藥血清不引起細胞凋亡。

圖4 不同濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對NSCs 分化的影響Fig.4 Effects of different concentrations of asperosaponin Ⅵmedicated serum on NSCs differentiation

圖5 不同濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對NSCs 凋亡率的影響Fig.5 Effects of different concentrations of asperosaponin Ⅵmedicated serum on NSCs apoptosis rate

3.5 川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清高、中濃度對神經(jīng)干細胞相關(guān)mRNA 表達的影響 與空白對照組相比，高、中濃度組中Notch1、Tublin、caspase-3 mRNA表達升高（P＜0.05），Jagged1、Hes1、Sox2、Pax6 mRNA 表達降低（P＜0.05，P＜0.01）；高濃度組GFAPmRNA 表達升高（P＜0.05），中濃度組GFAPmRNA 表達降低（P＜0.01）；高濃度組Ngn1 mRNA 表達降低（P＜0.01），中濃度組Ngn1 mRNA 表達升高（P＜0.01）。見圖6。

3.6 中濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對GFAP、Tublin，Jagged1、caspase-3 蛋白表達的影響 Western blot 結(jié)果顯示，與空白對照組比較，中濃度組Tublin 蛋白表達升高（P＜0.01），GFAP、Jagged1 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖7，與基因表達的結(jié)果一致。說明川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清中濃度NSCs 向神經(jīng)元方向分化較多，而向膠質(zhì)細胞分化較少，與Jagged1 的表達水平降低密切相關(guān)。caspase-3 蛋白表達與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清中濃度對細胞凋亡無作用。

圖6 川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清高、中濃度對神經(jīng)干細胞相關(guān)mRNA 表達的影響Fig.6 Effects of high and medium concentrations of asperosaponin Ⅵmedicated serum on expression of NSCs related mRNA

圖7 中濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對GFAP、Tublin、Jagged1、caspase-3 蛋白表達的影響Fig.7 Effects of medium concentration of asperosaponin Ⅵmedicated serum on the relative expression of GFAP，Tublin，Jagged1 and caspase-3

4 討論

許多研究表明，中藥復(fù)方或單體對神經(jīng)干細胞的增殖和分化有重要作用。如黃芪甲苷可通過上調(diào)與細胞增殖相關(guān)基因Hes1、Hes5、cyclin D1 的表達促進神經(jīng)干細胞增殖［9］。姜黃素在體內(nèi)外均能促進NSCs 的增殖，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系［10］。人參皂苷Rg1 可在體外誘導(dǎo)脂肪干細胞增殖并向神經(jīng)元分化［11］。人參Rd 能在體內(nèi)外誘導(dǎo)NSCs 增殖，但對其分化無明顯促進作用［12］。人參皂苷Rg1、Rd1通過介導(dǎo)PI3K／Akt 信號通路促進體外培養(yǎng)的NSCs增殖，對腦缺血再灌注損傷模型的神經(jīng)干細胞有保護作用［13-14］。還有研究表明，淫羊藿苷、黃芪多糖、三七總皂苷、銀杏內(nèi)酯B、銀杏提取物、紅花、丹參、刺梨和龜板等中藥單體成分或中藥可明顯促進NSCs 增殖，或還可誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣細胞分化［15-17］。

鑒于中藥在臨床應(yīng)用中大多以復(fù)方形式進行配藥，其化學(xué)成分十分復(fù)雜，藥理作用具有多個靶點、多層次的特點，且體內(nèi)干擾因素較多。本文采用川續(xù)斷皂苷VI 含藥血清可盡可能的模擬體內(nèi)藥物活性成分與細胞間相互作用的微環(huán)境，更真實地反映中藥藥效，實現(xiàn)中藥體外實驗和體內(nèi)反應(yīng)相結(jié)合，使實驗結(jié)果更具有客觀性和可靠性［18］。

眾多研究表明，激活Notch 信號通路會抑制NSCs 向神經(jīng)元分化，促進NSCs 向星型膠質(zhì)細胞分化，抑制NSCs 向少突膠質(zhì)細胞分化。阻斷Notch信號通路，則促進NSCs 向神經(jīng)元分化［19-20］。Notch信號通路的Ngn1 可阻斷干細胞Jak／STAT 信號途徑，抑制NSCs 增殖，并誘導(dǎo)神經(jīng)元的生成。而Hes1 可誘導(dǎo)細胞周期蛋白表達，促進干細胞增殖，抑制NSCs 分化。活化的Notch 信號通路可以增加Hes1 和Hes5 的表達，進而使細胞周期蛋白表達上調(diào)，促進干細胞增殖［21-22］。本文結(jié)果顯示，高、中濃度含藥血清中Hes1 mRNA 表達降低，可能是由于配體Jagged1 表達下調(diào)，導(dǎo)致Notch 信號通路被抑制引起的。Hes1 mRNA 表達降低使NSCs 的增殖受到抑制，因此在高、中濃度組中神經(jīng)干細胞均未見顯著增殖。Ngn1 mRNA 表達在中濃度組表達顯著上調(diào)，說明中濃度含藥血清誘導(dǎo)Ngn1 mRNA表達。免疫熒光和免疫印跡檢測結(jié)果均表明，中濃度組神經(jīng)元比例較高，且Tublin 蛋白表達升高。表明中濃度含藥血清可能通過抑制Notch 信號通路，增強Ngn1 mRNA 表達，進而誘導(dǎo)NSCs 向神經(jīng)元分化。

Sox2 在發(fā)育早期對于維持NSCs 的自我更新及多向分化潛能具有關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，可直接作用于GFAP基因而抑制其表達，對神經(jīng)元前體細胞的分化起到至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。Sox2 可以通過上調(diào)survivin 蛋白表達而抑制caspase-9 的活性，從而調(diào)控NSCs 的存活，而PI3K／Akt 通路可調(diào)控Sox2的表達［23］。加入高、中濃度含藥血清后，Sox2 mRNA 表達顯著降低，可能是由于PI3K／Akt 通路發(fā)生改變引起的。在中濃度組中，GFAPmRNA 和蛋白表達均顯著降低，可能是由于Sox2 mRNA 表達下調(diào)引起的，與中濃度含藥血清不能促進NSCs向膠質(zhì)細胞分化的結(jié)果一致。Pax6 參與調(diào)控神經(jīng)干細胞向多巴胺能神經(jīng)元的分化，可能也參與海馬的發(fā)育過程中。本文結(jié)果顯示，高、中濃度組其表達水平顯著降低，說明這2 種濃度的含藥血清抑制Pax6 mRNA 表達。

綜上，高、中濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對Notch 通路有顯著作用，可抑制配體Jagged1mRNA表達而阻礙該通路，從而促使NSCs 向神經(jīng)元方向分化。但高濃度含藥血清細胞毒性作用較大，導(dǎo)致細胞凋亡率升高。而中濃度含藥血清既可誘導(dǎo)NSCs 向神經(jīng)元分化，又不導(dǎo)致細胞凋亡，可望成為治療神經(jīng)退行性疾病備選藥物。