李麗靜 王領弟 吳曉光

（1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥學部， 河北 承德067000； 2.河北省中藥開發(fā)與研究重點實驗室， 河北 承德067000）

缺氧缺血性腦損傷是臨床常見的一大類中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，有較高的發(fā)病率和死亡率，其主要機制是腦缺血引起神經(jīng)細胞凋亡，從而造成腦的相應區(qū)域的功能障礙［1］。尋找抑制缺氧缺血后神經(jīng)細胞凋亡的有效藥物，對改善缺血性腦損傷尤為重要。近年來，研究發(fā)現(xiàn)中藥具有抗腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡的作用，探討中藥抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用機制具有重要意義［2］。山楂葉總黃酮是從山楂葉中提取的黃酮類化合物，在心、腦血管以及其他方面具有很好的藥理作用［3］。有報道發(fā)現(xiàn)山楂葉總黃酮可抑制神經(jīng)元凋亡，改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能［4］。山楂葉總黃酮還能通過上調(diào)Bcl-2／Bax 比值、下調(diào)caspase-3 表達抑制心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡［5］。有研究發(fā)現(xiàn)在缺氧復氧誘導的心肌細胞中miR-133b-5p 下調(diào)表達，上調(diào)其表達能抑制缺氧復氧誘導的細胞凋亡［6］。X-連鎖的RNA 結合基序蛋白（RNA Binding Motif protein，X-Linked，RBMX） 位于人類X 染色體上，對大腦發(fā)育至關重要［7］。脊髓損傷后RBMX表達增加，且在脊髓損傷后神經(jīng)元的凋亡、星形膠質(zhì)細胞的增殖過程中發(fā)揮重要作用［8］。然而山楂葉總黃酮、miR-133b-5p 對缺氧復氧誘導的神經(jīng)細胞損傷的影響及其機制尚不清楚，本實驗旨在研究山楂葉總黃酮、miR-133b-5p 對缺氧復氧誘導的神經(jīng)細胞損傷的影響及其機制是否與RBMX 有關。

1 材料

1.1 細胞株 人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y 購自中國科學院上海細胞庫，于10% FBS 高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細胞。

1.2 藥物與試劑 山楂葉總黃酮購自西安斯諾特生物技術有限公司；胎牛血清（FBS，貨號16000-044）、胰蛋白酶（貨號25200-056）、DMEM 培養(yǎng)液（貨號C11965500BT） 購自美國Gibco 公司；反轉錄試劑盒（貨號RR037A）、實時熒光定量試劑盒（貨號RR092C） 購自日本Takara 公司；Trizol試劑盒（貨號15596026）、LipofectamineTM2000 轉染試劑（貨號11668-019） 購自美國Invitrogen 公司；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA） 試劑盒（貨號23235）、二甲基亞砜（DMSO，貨號D8418-50ML）、RIPA 蛋白裂解液（貨 號YB20101ES60） 購自美國Sigma 公司；聚偏二氟乙烯膜（PVDF，貨號044080） 購自美國Alfa 公司；十二烷基硫酸鈉，鈉鹽-聚丙烯酰胺凝膠電泳（dodecyl sulfate，sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（貨號P0012A） 購自北京碧云天生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC） 和碘化丙錠（PI） 試劑盒（貨號CA1020）、LDH 試劑盒（貨號BC0685）、SOD 試劑盒（貨號BC0170）、MDA 試劑盒（貨號BC0025） 購自北京索萊寶生物科技有限公司；兔抗人Bax 多克隆抗體（貨號XYB343Hu01）、兔抗人Bcl-2 多克隆抗體（貨號XYA778Mu01）、兔抗人GAPDH 多克隆抗體（貨號xyKF703） 購自上海信裕生物科技有限公司；兔抗人RBMX 多克隆抗體（貨號LS-C170358）、山羊抗兔IgG 辣根過氧化物酶（HRP，貨號SE134） 購自上海恒斐生物科技有限公司；miR-NC、miR-133b、anti-miR-NC、anti-miR-133b、WT-RBMX 和MUT-RBMX 載體質(zhì)粒購自金瑞斯生物科技公司。

1.3 儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國Precision Scientific 公司；LightCycler480 熒光定量PCR 儀購自美國Roche 公司；Thermo FC 酶標儀購自美國Thermo 公司；FACS caliber 流式細胞儀、PowerPac蛋白電泳儀、Gel Doc XR＋凝膠顯示系統(tǒng)購自美國BD 公司。

2 方法

2.1 H／R 模型建立 將神經(jīng)細胞用無血清低糖的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于持續(xù)充入95% N2、5%CO2的密閉缺氧培養(yǎng)箱中缺氧處理2 h，然后更換為含10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的無菌箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

2.2 細胞轉染及分組 山楂葉總黃酮低、中、高劑量（10、30、90 mg／L） 培 養(yǎng)SH-SY5Y 細 胞24 h，進 行H／R 處 理。將miR-NC、miR-133b、anti-miR-NC、anti-miR-133b 質(zhì)粒轉染至SH-SY5Y細胞中分別記為miR-NC組、miR-133b組、antimiR-NC組、anti-miR-133b組。miR-NC、miR-133b質(zhì)粒轉染至SH-SY5Y 細胞6 h，進行缺氧復氧處理，記為H／R＋miR-NC組、H／R＋miR-133b組。將anti-miR-NC、anti-miR-133b 轉染至SH-SY5Y 細胞6 h，90 mg／L 山楂葉總黃酮處理24 h，再進行H／R 處理，記為山楂葉總黃酮＋anti-miR-NC組，山楂葉總黃酮＋anti-miR-133b組。

2.3 RT-PCR 檢測細胞miR-133b、RBMXmRNA表達 正常組、模型組、山楂葉總黃酮（低、中、高劑量）組、H／R ＋miR-NC組、H／R ＋miR-133b組、山楂葉總黃酮＋anti-miR-NC組，山楂葉總黃酮＋anti-miR-133b組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取各組細胞總RNA，將RNA 反轉錄為cDNA，依據(jù)熒光定量試劑盒說明，miR-133b、RBMX分別以U6 和GAPDH為內(nèi)參進行PCR 擴增，循環(huán)條件為95℃、30 s，60℃、30 s；72℃、30 s，共40個循環(huán)；60℃延長5 min。每個樣品重復3 次，采用2-△△ct法分析相對表達量。

2.4 Western blot 法檢測RBMX、Bax、Bcl-2 蛋白表達 各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入RIPA 細胞裂解液于冰上裂解30 min；4℃、12 000g離心15 min，取上清。BCA 試劑盒測定蛋白樣品濃度后進行SDS-PAGE，電泳結束后，將蛋白電轉至PVDF 膜上，50 g／L 脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入兔抗人Bax 多克隆抗體、兔抗人Bcl-2 多克隆抗體、兔抗人RBMX 多克隆抗體、兔抗人GAPDH 多克隆抗體，4℃過夜；洗膜后，加入二抗山羊抗兔IgGHRP，室溫孵育2 h；TBST 洗膜3 次，10 min／次。在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One 凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達，實驗重復3 次。

2.5 檢測LDH、SOD、MDA 水平 各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取細胞培養(yǎng)上清液，按照LDH 試劑盒說明書檢測細胞培養(yǎng)液中LDH 水平；細胞培養(yǎng)48 h后，去除培養(yǎng)基，用PBS 洗3 遍，細胞裂解、離心，取上清，按照試劑盒說明書進行操作檢測細胞中SOD、MDA 水平，每組重復3 次。

2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化，4℃、300g離心10 min。預冷PBS 洗滌后重懸。按照Annexin V-FITC／PI 細胞凋亡檢測試劑盒說明書，分別加入5 μL annexin V-FITC 和10 μL PI，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測激發(fā)波長488 nm 和發(fā)射波長530 nm 處的熒光強度，實驗重復3 次。

2.7 熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-133b 對RBMX 的靶向調(diào)控 TargetScan 數(shù)據(jù)庫顯示RBMX 3′UTR 區(qū)域有miR-133b 結合位點。構建野生型和突變型基因靶點RBMX 的3′UTR 熒光素酶表達載體（WT-RBMX 和MUT-RBMX），取對數(shù)生長期SH-SY5Y 細胞接種于24 孔板（1×103／孔），待細胞生長至80%匯合時，用LipofectamineTM 2 000 分別將 WT-RBMX 和 MUT-RBMX 質(zhì) 粒轉染到SH-SY5Y，同時分別轉染miR-133b 和miR-NC 質(zhì)粒。依據(jù)說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結果以熒光素酶活性和Renilla 活性的比值進行統(tǒng)計學分析，實驗重復3 次。

2.8 統(tǒng)計學分析 實驗中每個樣本均重復3 次，每次設3個復孔。使用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 山楂葉總黃酮對H／R 誘導的神經(jīng)細胞損傷的影響 與正常組相比，模型組LDH、MDA 水平升高，SOD 水平降低，Bcl-2 蛋白表達降低，Bax 蛋白表達升高，細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組相比，山楂葉總黃酮低、中、高劑量組LDH、MDA 水平降低，SOD 水平升高，Bcl-2 蛋白表達升高，Bax 蛋白表達降低，細胞凋亡率降低（P＜0.05），呈濃度依賴性，見表1、圖1。山楂葉總黃酮可改善H／R 誘導的神經(jīng)細胞損傷。

表1 山楂葉總黃酮對H／R 誘導的神經(jīng)細胞損傷的影響（， n＝3）Tab.1 Effects of HLF on H／R-induced neuronal injury（， n＝3）

表1 山楂葉總黃酮對H／R 誘導的神經(jīng)細胞損傷的影響（， n＝3）Tab.1 Effects of HLF on H／R-induced neuronal injury（， n＝3）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與山楂葉總黃酮低劑量組比較，＆P＜0.05；山楂葉總黃酮中劑量組比較，▲P＜0.05。

3.2 山楂葉總黃酮對H／R 誘導的神經(jīng)細胞中miR-133b、RBMX 表達的影響 與正常組相比，模型組miR-133b 表達降低，RBMXmRNA 和蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組相比，山楂葉總黃酮低、中、高劑量組miR-133b 表達升高，RBMXmRNA和蛋白表達降低（P＜0.05），呈濃度依賴性，見圖2、表2。山楂葉總黃酮抑制H／R 誘導的神經(jīng)細胞中RBMX 表達，促進miR-133b 表達。

圖1 山楂葉總黃酮對H／R 誘導的神經(jīng)細胞凋亡的影響Fig.1 Effects of HLF on H／R-induced neuronal apoptosis

圖2 Western blot 檢測RBMX 蛋白表達Fig.2 Expression of RBMX protein by Western blot

3.3 miR-133b 靶向調(diào)控RBMX 的表達 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預測到RBMX 與miR-133b 存在結合位點（圖3A）。熒光素酶報告基因檢測實驗結果顯示（表3），相較于miR-NC組，miR-133b組WT-RBMX 的神經(jīng)細胞熒光素酶活性降低（P＜0.05）；而MUT-RBMX 的神經(jīng)細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義。Western blot 檢測結果顯示（圖3B、表4），相較于miR-NC組，miR-133b組RBMX 表達降低；而相較于anti-miR-NC組，antimiR-133b組RBMX 表達水平升高（P＜0.05）。miR-133b 靶向調(diào)控RBMX 的表達。

表2 山楂葉總黃酮對H／R 誘導的神經(jīng)細胞中miR-133b和RBMX 表達的影響（， n＝3）Tab.2 Effects of HLF on expression of miR-133b and RBMX in H／R-induced neurons（， n＝3）

表2 山楂葉總黃酮對H／R 誘導的神經(jīng)細胞中miR-133b和RBMX 表達的影響（， n＝3）Tab.2 Effects of HLF on expression of miR-133b and RBMX in H／R-induced neurons（， n＝3）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與山楂葉總黃酮低劑量組比較，＆P＜0.05；山楂葉總黃酮中劑量組比較，▲P＜0.05。

圖3 miR-133b 靶向調(diào)控RBMX 的表達Fig.3 miR-133b target regulation on RBMX expression

表3 雙熒光素酶報告實驗（， n＝3）Tab.3 Dual luciferase reporter experiment（， n＝3）

表3 雙熒光素酶報告實驗（， n＝3）Tab.3 Dual luciferase reporter experiment（， n＝3）

注：與miR-NC組比較，*P＜0.05。

表4 miR-133b 調(diào)控RBMX 蛋白的表達（， n＝3）Tab.4 miR-133b regulation on the expression of RBMX protein（， n＝3）

表4 miR-133b 調(diào)控RBMX 蛋白的表達（， n＝3）Tab.4 miR-133b regulation on the expression of RBMX protein（， n＝3）

注：與miR-NC組比較，* P ＜0.05；與anti-miR-NC組比較，＃P＜0.05。

3.4 miR-133b 過表達對H／R 誘導的神經(jīng)細胞損傷的影響 與正常組相比，模型組LDH、MDA 水平升高，SOD 水平降低，miR-133b、Bcl-2 表達降低，Bax 蛋白表達升高，細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與H／R＋miR-NC組相比，H／R＋miR-133b組 LDH、MDA 水平降低，SOD 水平升高，miR-133b、Bcl-2 表達升高，Bax 蛋白表達降低，細胞凋亡率降 低（P＜0.05）（圖4、表5）。miR-133b過表達保護H／R 誘導的神經(jīng)細胞損傷。

圖4 Western blot 檢測凋亡相關蛋白的表達Fig.4 Expression of apoptosis-related proteins by Western blot

表5 miR-133b 過表達對H／R 誘導的神經(jīng)細胞損傷的影響（， n＝3）Tab.5 Effect of miR-133b overexpression on H／R-induced neuronal injury（， n＝3）

表5 miR-133b 過表達對H／R 誘導的神經(jīng)細胞損傷的影響（， n＝3）Tab.5 Effect of miR-133b overexpression on H／R-induced neuronal injury（， n＝3）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與H／R＋miR-NC組比較，＃P＜0.05。

3.5 抑制miR-133b 表達逆轉了山楂葉總黃酮對H／R 誘導的神經(jīng)細胞損傷的作用 與模型組相比，山楂葉總黃酮高劑量組LDH、MDA 水平降低，SOD 水平升高，miR-133b、Bcl-2 蛋白表達升高，RBMX、Bax 蛋白表達降低，細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與山楂葉總黃酮＋anti-miR-NC組相比，山楂葉總黃酮＋anti-miR-133b組LDH、MDA 水平升高，SOD 水平降低，miR-133b、Bcl-2 表達降低，RBMX、Bax 蛋白表達升高，細胞凋亡率升高（P＜0.05），見表6、圖5。抑制miR-133b 表達逆轉了山楂葉總黃酮對H／R 誘導的神經(jīng)細胞損傷的改善作用。

4 討論

腦缺血再灌注會產(chǎn)生大量氧自由基和有毒活性氧，造成氧化應激反應從而導致細胞凋亡，而細胞凋亡可導致腦缺血性神經(jīng)損傷，中藥在預防和治療缺血再灌注損傷和神經(jīng)性疾病中扮演重要角色［9］。研究報道山楂葉總黃酮可降低缺氧再給氧后LDH、MDA 水平，提高SOD 水平從而增強細胞抗氧化作用，減少自由基及脂質(zhì)過氧化物導致的細胞膜損傷，抑制缺氧再給氧損傷心肌細胞凋亡，從而改善心肌細胞缺氧再給氧損傷［10］。山楂葉總黃酮還能降低caspase-3 表達，改善H2O2誘導的乳鼠心肌細胞氧化應激和細胞凋亡［11］。此外，山楂葉總黃酮可提高腦組織中SOD 活性，降低MDA 及NO 含有量，從而減輕腦缺血再灌注神經(jīng)細胞損傷［12］。本實驗結果顯示，山楂葉總黃酮可提高H／R 誘導的神經(jīng)細胞中SOD 水平，降低LDH、MDA 水平，降低細胞凋亡率。說明，山楂葉總黃酮可保護H／R誘導的神經(jīng)細胞損傷，其可能與提高細胞內(nèi)的抗氧化能力有關。

表6 抑制miR-133b 表達逆轉了山楂葉總黃酮對H／R 誘導的神經(jīng)細胞損傷的作用（， n＝3）Tab.6 Inhibited miR-133b expression on reversing HLF effect to H／R-induced neuronal injury（， n＝3）

表6 抑制miR-133b 表達逆轉了山楂葉總黃酮對H／R 誘導的神經(jīng)細胞損傷的作用（， n＝3）Tab.6 Inhibited miR-133b expression on reversing HLF effect to H／R-induced neuronal injury（， n＝3）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與山楂葉總黃酮＋anti-miR-NC組比較，＃P＜0.05。

圖5 Western blot 檢測RBMX 和凋亡相關蛋白表達Fig.5 RBMX and apoptosis-related protein expression by Western blot

據(jù)報道m(xù)iRNA 參與缺血性腦卒中的氧化應激、細胞凋亡、再灌注損傷等病理生理過程，miRNA對早期干預治療缺血性腦卒中有一定意義［13］。研究［14］發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-133b 能降低神經(jīng)細胞凋亡，保護甲基苯丙胺誘導的神經(jīng)損傷。過表達miR-133b可增加心肌細胞活力，降低LDH 活性及心肌細胞凋亡率，減輕心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注損傷［15］。本實驗結果顯示，miR-133b 過表達也可提高H／R 誘導的神經(jīng)細胞中SOD 水平，降低LDH、MDA 水平，降低細胞凋亡率。說明miR-133b 過表達能改善H／R 誘導的神經(jīng)細胞損傷。還有研究報道嗎啡預處理通過上調(diào)miR-133b-5p，進一步抑制靶基因Fas表達，從而減輕心肌細胞缺血再灌注缺氧再給氧損傷［16］。本實驗結果顯示，山楂葉總黃酮可提高miR-133b 的表達，而抑制miR-133b 表達逆轉了山楂葉總黃酮對H／R 誘導的神經(jīng)細胞損傷的保護作用。說明山楂葉總黃酮可能通過調(diào)控miR-133b 表達改善H／R 誘導的神經(jīng)細胞損傷。

研究發(fā)現(xiàn)RBMX 與人乳腺癌促凋亡基因Bax正相關，可能參與細胞凋亡［17］。RBMX 是DNA 抵御外來損傷的重要因素，是一種腫瘤抑制因子［18-19］。光損傷后RBMX 在視網(wǎng)膜中的表達增加，RBMX 可能在視網(wǎng)膜光損傷后神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡過程中發(fā)揮重要作用［20］。本實驗結果顯示，山楂葉總黃酮可降低RBMX 的表達，且miR-133b 靶向調(diào)控RBMX 的表達。提示山楂葉總黃酮可能通過調(diào)控miR-133b，進而下調(diào)RBMX 的表達，改善H／R誘導的神經(jīng)細胞損傷。

綜上所述，山楂葉總黃酮及過表達miR-133b對缺氧復氧誘導的神經(jīng)細胞損傷有保護作用，其機制可能與下調(diào)RBMX 表達及提高抗氧化能力有關。