吳 鑫左雯雯金立陽(yáng)李存玉*彭國(guó)平

（1.江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院， 江蘇 淮安223001； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 南京210023）

中藥生產(chǎn)過(guò)程中有效成分的提取、精制是影響產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而成分之間的相互作用將直接影響生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量傳遞［1-2］，特別是富含酸堿類成分的中藥復(fù)方［3］。目前研究認(rèn)為，中藥酸堿復(fù)合物反應(yīng)成鹽引起的分子量變大、溶解度降低等現(xiàn)象會(huì)在濃縮、醇沉等制藥環(huán)節(jié)造成成分的損失［4-6］。但酸堿化合物存在酸堿性強(qiáng)弱的區(qū)別，其成分存在復(fù)合成鹽反應(yīng)的同時(shí)，也會(huì)生成一種介于游離態(tài)與復(fù)鹽態(tài)之間的存在狀態(tài)，即官能團(tuán)之間以較弱分子間作用力結(jié)合的締合態(tài)［7］，但迄今為止有關(guān)研究相對(duì)薄弱。

紫外分光光度法是一種根據(jù)吸收光譜來(lái)研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)及其相互作用的有效手段［8］，每種物質(zhì)均具有不同的空間結(jié)構(gòu)，吸收光能量情況也存在差異，具有獨(dú)特的光吸收譜線，因此可借助該方法判斷酸堿復(fù)合物配伍前后官能團(tuán)變化情況，同時(shí)通過(guò)核磁共振氫譜綜合判斷酸堿類成分在溶液中的存在狀態(tài)。由于存在狀態(tài)的改變會(huì)影響分子大小與荷電特征，故本實(shí)驗(yàn)采用以分子篩分、道南效應(yīng)為主要分離原理的超濾和納濾分離技術(shù)，對(duì)中藥代表性酚酸成分沒(méi)食子酸與堿性呈梯度變化的生物堿進(jìn)行配伍，分析膜分離行為，研究該類成分在溶液中的存在狀態(tài)，以期為中藥復(fù)方的精制分離提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 儀器 NF-1812-S2型膜分離實(shí)驗(yàn)裝置（海安宏麥機(jī)械有限公司）；聚醚砜超濾膜［截留分子量10 kDa，星達(dá)（泰州） 膜科技有限公司］；聚酰胺納濾膜（截留分子量600～800 Da，南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司）；FA-1004型電子天平（萬(wàn)分之一）、FA-2204型電子天平（十萬(wàn)分之一）（上海安亭電子儀器廠）；KH-250B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；Avance 400型核磁共振儀（德國(guó)Bruker 公司）；T6 新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試劑與藥物 沒(méi)食子酸（批號(hào)FY180106，純度≥98%）、苦參堿（批號(hào)FY180120，純度≥98%）、苦參素（批號(hào)FY180130，純度≥98%）、槐定堿（批號(hào)FY170911，純度≥98%）、漢防己甲素（批號(hào)FY171203，純度≥98%）、金雀花堿（批號(hào)FY170325，純度≥98%）、秋水仙堿（批號(hào)FY171206，純度≥98%） 原料藥均購(gòu)于鄭州豐耀農(nóng)業(yè)科技有限公司；沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)110831-201204） 購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。氘代二甲基亞砜（DMSO-d6，純度99.9%） 購(gòu)于美國(guó)CIL 公司；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，置于10 mL 量瓶中，流動(dòng)相溶解并定容至刻度，即得（質(zhì)量濃度為0.125 mg／mL）。

2.2 膜分離原液制備

2.2.1 單一供試品溶液 稱取沒(méi)食子酸原料藥適量，純化水制成質(zhì)量濃度為0.15 mg／mL 的藥液，超聲處理15 min，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.2 混合供試品溶液 以1∶1、1∶3、1∶6 比例稱取沒(méi)食子酸、生物堿適量，純化水制成沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為0.15 mg／mL 的混合溶液，超聲處理15 min，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 分光光度法待測(cè)溶液 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備，沒(méi)食子酸與生物堿比例為1∶3。

2.4 核磁樣品

2.4.1 單一供試品溶液 稱取沒(méi)食子酸、苦參堿、苦參素、金雀花堿、槐定堿原料藥適量，加入0.6 mL氘代水，振蕩溶解，8 000 r／min 離心5 min，轉(zhuǎn)移到5 mm 外徑核磁管中，即得。

私權(quán)觀念和科學(xué)態(tài)度是知識(shí)產(chǎn)權(quán)戰(zhàn)略的根本保障——紀(jì)念《國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)戰(zhàn)略綱要》頒布實(shí)施十年............................................................................................劉春田 06.03

2.4.2 混合供試品溶液 稱取沒(méi)食子酸適量，與生物堿以1∶3 比例混合，加入0.6 mL 氘代水溶解，8 000 r／min 離心5 min，轉(zhuǎn)移到5 mm 外徑核磁管中，即得。

2.5 色譜條件 參考文獻(xiàn)［9］。采用Hedera ODS-2 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-0.1% 三氟乙酸（20∶ 80）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.6 膜分離實(shí)驗(yàn) 選取已用純化水清洗至中性條件下的超濾膜，組裝超濾系統(tǒng)。采用1 kD 超濾膜進(jìn)行超濾（操作溫度25℃，操作壓力13.79 kPa），將超濾系統(tǒng)的進(jìn)液端、超濾端、截流端放入裝有“2.2.1” 項(xiàng)下供試品溶液的容器內(nèi)進(jìn)行循環(huán)，待吸附-解吸附達(dá)到平衡時(shí)將容器內(nèi)溶液攪拌均勻，作為平衡液，將超濾端取出進(jìn)行濾液收集，待超濾完全后混勻，取出超濾液，計(jì)算透過(guò)率（T），公式為T＝（C超濾／C平衡） ×100%，其中C超濾是超濾液中溶質(zhì)質(zhì)量濃度，單位mg／mL；C平衡是平衡液中溶質(zhì)質(zhì)量濃度，單位mg／mL。納濾操作步驟同超濾。

2.7 紫外可見(jiàn)分光光度實(shí)驗(yàn) 將待測(cè)空白水溶液及樣品置于同一石英比色皿中，室溫下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（190～600 nm），每1 nm 采集一次數(shù)據(jù)，掃描速度10 nm／s。

2.8 高場(chǎng)核磁實(shí)驗(yàn) NMR 數(shù)據(jù)的1H 圖譜由Bruker Avance 400 核磁共振波譜儀在恒溫（25℃）下采集得到，采用zg30 脈沖序列，具體參數(shù)為譜寬（SWH） 8 223；采樣點(diǎn)數(shù)（TD） 65 K；采樣時(shí)間（AQ） 3.98 s；弛豫延遲時(shí)間（D1） 1 s；采樣次數(shù)（NS） 16 次；增益次數(shù)（RG） 124。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)合物膜分離情況 沒(méi)食子酸為酸性化合物，當(dāng)與不同堿性的生物堿配伍時(shí)可起到調(diào)節(jié)溶液酸堿性的作用，使其呈分子態(tài)或離子態(tài)。當(dāng)溶液pH ＝pKa-2 時(shí)，該成分主要以游離態(tài)形式存在；當(dāng)溶液pH ＝pKa＋2 時(shí)，該成分主要以離子態(tài)形式存在。

選取pKa 值不一樣的5 種生物堿（槐定堿、金雀花堿、苦參堿、苦參素、秋水仙堿） 與沒(méi)食子酸進(jìn)行配伍，其中槐定堿分子量、pKa 分別為248 Da、8.97［10］，金雀花堿分別為234 Da、8.1，苦參堿分別為248 Da、7.7，苦參素分別為264 Da、5.8［11］，秋水仙堿分別為399 Da、1.84，沒(méi)食子酸與不同生物堿配伍的透過(guò)率見(jiàn)表1。由此可知，兩者以1∶1 比例配伍時(shí)超濾透過(guò)率無(wú)明顯變化，而在納濾條件下略微下降；隨著配伍比例升高（1∶3、1∶6），透過(guò)率均呈顯著下降趨勢(shì)，并且在生物堿堿性增強(qiáng)時(shí)更為明顯，表明沒(méi)食子酸透過(guò)率與酸堿pKa 差值呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。

表1 沒(méi)食子酸-生物堿配伍透過(guò)率測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of transmittance determination of gallic acid-alkaloids compatibility

在超濾、納濾條件下，單一沒(méi)食子酸提取液中的透過(guò)率相似，均在81% 左右；復(fù)合溶液中沒(méi)食子酸與堿性較強(qiáng)的生物堿（槐定堿、金雀花堿、苦參堿） 配伍后，納濾透過(guò)率下降程度大于超濾，約在10%左右，而與堿性較弱的生物堿（苦參素、秋水仙堿） 配伍后，2 種膜分離差異不明顯。

沒(méi)食子酸透過(guò)率的變化是因?yàn)樵摮煞峙c生物堿形成酸堿混合物，并且由于堿性強(qiáng)弱其存在狀態(tài)也不盡相同。以沒(méi)食子酸、金雀花堿為例，兩者在1∶3 配伍比例下的超濾透過(guò)率較未配伍下降36.88%，而納濾透過(guò)率下降47.59%。超濾分離是基于孔徑篩分原理［12］，沒(méi)食子酸與生物堿配伍后有一部分形成特殊混合物，分子量升高，透過(guò)率下降，并以復(fù)合態(tài)或締合態(tài)的形式存在。根據(jù)納濾膜分離的電荷效應(yīng)［13］，推斷沒(méi)食子酸與金雀花堿以1∶3 比例配伍時(shí)，所形成的混合物中締合態(tài)與復(fù)合態(tài)共存，并且有10%以小分子離子態(tài)形式存在；苦參素、秋水仙堿堿性較弱，故與沒(méi)食子酸配伍時(shí)大多形成分子間作用力較弱的締合態(tài)。

3.2 紫外吸收光譜考察 圖1（金雀花堿本身紫外吸收譜圖復(fù)雜，故未納入研究）、表2 顯示，沒(méi)食子酸具有明顯的苯環(huán)吸收帶特征，譜帶1 為B吸收帶（λmax＝269 nm），譜帶2 為K 吸收帶（λmax＝219 nm）。沒(méi)食子酸與堿性較強(qiáng)的苦參堿、槐定堿配伍時(shí)，譜帶1 的λmax發(fā)生不同程度的藍(lán)移，而譜帶2 的λmax出現(xiàn)紅移，2 條譜帶λmax所對(duì)應(yīng)的吸光度有所下降；與苦參素配伍時(shí)，譜帶1、2 的λmax與對(duì)應(yīng)吸光度的變化不明顯；與秋水仙堿配伍時(shí)，因?yàn)樗酋０穳A而不與酸反應(yīng)，故基本沒(méi)有變化。由此可知，酸堿類成分配伍時(shí)由于存在狀態(tài)不同，導(dǎo)致混合物的光化學(xué)行為不一樣。

酸堿類成分配伍時(shí)，生物堿上氨基首先與沒(méi)食子酸苯環(huán)上羧基部分結(jié)合，由于堿性基團(tuán)的存在使得羰基吸電子能力增強(qiáng)，苯環(huán)的π→π*躍遷能量增高，故譜帶1 的λmax出現(xiàn)藍(lán)移。堿性較強(qiáng)的苦參堿與槐定堿進(jìn)一步與苯環(huán)上羥基結(jié)合而形成羧基陰離子，使得p-π 共軛增強(qiáng)，故譜帶2 的λmax出現(xiàn)紅移。

表2 沒(méi)食子酸-生物堿配伍最大吸收波長(zhǎng)（λmax）、吸光度測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of maximum absorption wavelength（λmax） and absorbance determination of gallic acid-alkaloids compatibility

另外，秋水仙堿的堿性極弱，故在水溶液中不與沒(méi)食子酸發(fā)生作用；其他生物堿除了形成締合物外，還能進(jìn)一步與沒(méi)食子酸發(fā)生反應(yīng)而形成酸堿復(fù)鹽。

3.3 沒(méi)食子酸復(fù)合物高場(chǎng)核磁結(jié)構(gòu)解析 通過(guò)膜分離技術(shù)和紫外全掃描可知，不同堿性的生物堿與沒(méi)食子酸配伍后，由于復(fù)合物存在狀態(tài)不同導(dǎo)致其透過(guò)率、λmax存在差異。

1H-NMR 被廣泛用于化合物結(jié)構(gòu)解析，故本實(shí)驗(yàn)采用該技術(shù)進(jìn)一步分析復(fù)合物不同官能團(tuán)結(jié)合的區(qū)別。將沒(méi)食子酸與生物堿配伍后的復(fù)合物溶于D2O 中，發(fā)現(xiàn)其氫譜化學(xué)位移（400 MHz，D2O ＝90∶10）δ為6.91（2H，s，2，6-H），8.82（1H，s，4-OH），9.17（2H，s，3，5-OH），12.22（1H，s，1-OH）。沒(méi)食子酸與金雀花堿、槐定堿、苦參堿、苦參素配伍后，1-OH、3，5-OH、4-OH 的氫化學(xué)位移消失，而與秋水仙堿配伍后其變化不明顯，這是由于堿性較強(qiáng)的金雀花堿、槐定堿、苦參堿與羧基、酚羥基均能結(jié)合，使氫核外電子云密度降低，氫化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)；苦參素因其中1個(gè)N 形成N-O 原子，故只有1個(gè)N 結(jié)合；秋水仙堿是酰胺堿，堿性極弱，與沒(méi)食子酸不成鹽，故化學(xué)位移無(wú)明顯變化。

復(fù)合鹽中主要存在離子作用力，而締合物則主要通過(guò)氫鍵作用相互連接而成，由于離子鍵作用力一般強(qiáng)于氫鍵，故在碳譜中的化學(xué)位移也存在明顯區(qū)別，將沒(méi)食子酸分別與生物堿及NaOH 配伍，用D2O 溶解后進(jìn)行核磁碳譜檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。由此可知，加入金雀花堿、槐定堿、苦參堿、苦參素后沒(méi)食子酸δC＝O、δ1-C值向低場(chǎng)位移，與秋水仙堿配伍后變化不明顯；沒(méi)食子酸與NaOH 配伍成鹽后，化學(xué)位移變化明顯，其中C ＝O、1-C 變化較大，并且兩者位移差值大于與生物堿配伍后，間接表明沒(méi)食子酸與生物堿并未以較強(qiáng)的離子作用力結(jié)合，推測(cè)兩者可能主要以氫鍵形式結(jié)合形成締合物，有一部分形成復(fù)鹽。生物堿上氨基與沒(méi)食子酸上羰基、酚羥基形成氫鍵后，吸電子效應(yīng)使得相應(yīng)官能團(tuán)碳核外圍電子云密度降低，故δ值向低場(chǎng)位移，但由于生物堿堿性不同，故氨基與酚羥基結(jié)合情況也有所差異。

表3 沒(méi)食子酸-生物堿配伍的13C-NMR 化學(xué)位移Tab.3 13C-NMR chemical shifts of gallic acid-alkaloids compatibility

4 討論

本實(shí)驗(yàn)以沒(méi)食子酸為研究對(duì)象，采用膜分離技術(shù)比較配伍前后存在狀態(tài)不同時(shí)透過(guò)率的變化情況，并結(jié)合紫外分光光度法和核磁技術(shù)探究酸堿復(fù)合物官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)特征。選擇堿性呈梯度變化的生物堿與沒(méi)食子酸反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)后者與pKa 差值不同的生物堿所生成的混合物在透過(guò)率下降程度、紫外最大吸收波長(zhǎng)、氫化學(xué)位移方面存在差異，這主要是由于混合物存在狀態(tài)不同所致，沒(méi)食子酸與堿性較強(qiáng)的生物堿配伍形成的混合物中，締合物與復(fù)合鹽共存，而與堿性較弱的生物堿配伍后一般只生成締合物。

中藥復(fù)方配伍后不同成分之間發(fā)生相互作用，對(duì)中藥制劑過(guò)程中有效成分的提取、分離、精制均會(huì)產(chǎn)生影響，尤其是酸堿類成分配伍，更易產(chǎn)生反應(yīng)。由于很多影響藥品質(zhì)量的關(guān)鍵工藝與溶液中分子存在狀態(tài)有關(guān)，故明確酸堿類成分反應(yīng)的內(nèi)在機(jī)理、反應(yīng)物不同狀態(tài)的組成比例，以及復(fù)合物的結(jié)構(gòu)變化，對(duì)中藥復(fù)方湯劑臨床合煎、另煎及相關(guān)制劑生產(chǎn)工藝的制定具有重要意義。