趙春草 符曉暉 楊清云 夏增華 吳 飛* 張繼全*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新中藥研究院， 中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心， 上海201203；2.上海同田生物技術(shù)股份有限公司， 上海201203； 3.蘇州凱祥生物科技有限公司， 江蘇 蘇州215600）

藏藥余甘子為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥成熟果實(shí)，民間及臨床上常將其用于治療高尿酸血癥和痛風(fēng)，安全性高，不良反應(yīng)少［1］，療效確切［2-6］，主要含有多酚、生物堿、維生素、氨基酸、微量元素［7］，性涼，味甘、酸、澀，功效清熱涼血、消食健胃、生津止咳。近年來，對(duì)余甘子藥理活性成分的研究逐漸增多［8-10］，發(fā)現(xiàn)沒食子酸、葡糖倍苷是其主要成分，課題組前期對(duì)兩者組成的余甘子總酚進(jìn)行了抗痛風(fēng)活性研究，確定其具有較好的成藥性。

本實(shí)驗(yàn)參考中藥創(chuàng)新藥物研究開發(fā)的相關(guān)要求，以余甘子多酚成分沒食子酸、葡糖倍苷含有量為指標(biāo)，研究余甘子總酚提取純化工藝，以期保證原料中間體質(zhì)量的均一、穩(wěn)定、可控，為該成分進(jìn)一步開發(fā)成中藥有效部位制劑的創(chuàng)新藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290型高效液相色譜儀，配置DAD 檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫科技公司）；XP205型電子分析天平［0.01 mg，梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］；HWS26型恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SC-150型不銹鋼層析柱（江蘇沙家浜化工設(shè)備有限公司）；LD-Y1000A型粉碎機(jī)（上海頂帥電器有限公司）；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）。

1.2 試劑與藥物 余甘子藥材（批號(hào)150815） 購(gòu)自安國(guó)市一方中藥材有限公司，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生藥教研室倪梁紅副教授鑒定為正品。沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)110831-201204） 購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；葡糖倍苷對(duì)照品（批號(hào)0761-20140922） 購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司。大孔吸附樹脂［型號(hào)AB-8，購(gòu)自天津正天成澄清技術(shù)有限公司；型號(hào)D101，購(gòu)自天津農(nóng)藥股份有限公司樹脂分公司；型號(hào)XAD1600，美國(guó)羅門哈斯（陶氏） 公司生產(chǎn)，購(gòu)自北京慧德易科技有限責(zé)任公司；型號(hào)Diaion HP-20，日本三菱公司生產(chǎn)，購(gòu)自北京綠百草科技發(fā)展有限公司；型號(hào)HZ-801，購(gòu)自上海華震科技有限公司］。乙腈、甲醇為色譜純，購(gòu)自德國(guó)Merck 公司；其余試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 總酚含有量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對(duì)照品適量，50%甲醇定容至10 mL 棕色量瓶中，制得質(zhì)量濃度1.187 mg／mL 的溶液，精密量取1 mL，50%甲醇稀釋至25 mL，即得質(zhì)量濃度47.48 μg／mL的溶液，同法依次稀釋成5.94、23.74、47.48、118.70、237.40、474.80 μg／mL。

精密稱取葡糖倍苷對(duì)照品適量，50%甲醇定容至10 mL 棕色量瓶中，制得質(zhì)量濃度1.138 mg／mL的溶液，精密量取1 mL，50%甲醇稀釋至10 mL，即得質(zhì)量濃度113.8 μg／mL 的溶液，同法依次稀釋 成 11.38、45.52、113.80、227.60、455.20、910.40 μg／mL。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取余甘子飲片粉末（過三號(hào)篩） 0.15 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇（A） -2%乙酸（B），梯度洗脫（0～3 min，95%A；3～10 min，95%～50% A；10～11 min，50%～10%A）；體積流量0.8 mL／min；柱溫35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm，進(jìn)樣量5 μL。色譜圖見圖1。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 線性關(guān)系考察 取“2.1.1” 項(xiàng)下2 種對(duì)照品溶液，在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣5 μL測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸，得方程分別為沒食子酸Y＝19.003X-32.543（r＝1）、葡糖倍苷Y＝9.685X-36.149（r＝0.999 9），分別在5.94～474.80、11.38～910.4 μg／mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4.2 精密度試驗(yàn) 取1.187 mg／mL 沒食子酸對(duì)照品溶液、1.138 mg／mL 葡糖倍苷對(duì)照品溶液，在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，每次5 μL，測(cè)得沒食子酸、葡糖倍苷峰面積RSD 分別為0.65%、0.22%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取余甘子飲片粉末（過三號(hào)篩），按“2.1.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、葡糖倍苷含有量RSD 分別為1.94%、1.00%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取余甘子飲片粉末（過三號(hào)篩），按“2.1.2” 項(xiàng)下方法平行制備2 份供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、葡糖倍苷峰面積RSD 分別為0.21%、0.10%，表明室溫下溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取14 mg 余甘子飲片粉末9 份，精密加入一定量沒食子酸、葡糖倍苷對(duì)照品溶液，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，沒食子酸、葡糖倍苷平均加樣回收率分別為100.37%、99.80%，RSD 分別為1.24%、0.90%。

2.2 提取工藝考察

2.2.1 單因素試驗(yàn) 取余甘子飲片50 g，以溶劑種類、提取次數(shù)、提取時(shí)間為影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)條件設(shè)3組平行對(duì)照。雖然水提取、70%乙醇提取時(shí)葡糖倍苷、沒食子酸轉(zhuǎn)移率均達(dá)到最大值，而且基本相同（圖2），但水提取時(shí)粗提取目標(biāo)部位純度較低，故采用乙醇作為提取溶劑。

圖2 沒食子酸、葡糖倍苷轉(zhuǎn)移率Fig.2 Transfer rates of gallic acid and glucogallin

2.2.2 正交試驗(yàn) 以溶劑用量（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C） 為影響因素，每個(gè)因素3個(gè)水平；以2 種成分轉(zhuǎn)移率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算綜合評(píng)分（Y），公式為Y＝（沒食子酸轉(zhuǎn)移率＋葡糖倍苷轉(zhuǎn)移率） ×0.5／100，應(yīng)用L9（34） 正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。因素水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

由此可知，各因素影響程度依次為提取次數(shù)（C） ＞提取時(shí)間（B） ＞溶劑用量（A），其中C有顯著影響（P＜0.05），最優(yōu)提取工藝為A1B3C3，即溶劑用量8 倍，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)3 次。但在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，第3 次提取后引入的雜質(zhì)量較大，給后續(xù)分離純化工作帶來困難，并導(dǎo)致純化效率降低，故將提取次數(shù)暫定為2 次。

2.2.3 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按“2.2.2” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，每批藥材取樣量為1 kg，結(jié)果見表4。另外還發(fā)現(xiàn)第2 次提取時(shí)間為1 h 時(shí)，提取效率與提取時(shí)間為2 h 時(shí)差異不大（相對(duì)誤差約為1%）。最終確定，最優(yōu)提取工藝為8 倍量70%乙醇回流提取2 次，第1 次2 h，第2次1 h。

2.3 純化工藝考察 余甘子提取后，粗提物中葡糖倍苷、沒食子酸總含有量為6.8%，為達(dá)到有效部位含有量不低于50%的要求，需作進(jìn)一步分離純化。由于對(duì)大孔吸附樹脂的研究相對(duì)較為成熟，被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離和富集［11-14］，故本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用該方法進(jìn)行考察。按“2.2.3” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝制備余甘子提取液，濃縮至浸膏，60℃下真空烘干，得到淺褐色干燥固體粉末，收率為48%，備用。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

表4 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.4 Results of verification tests for extraction process（n＝3）

2.3.1 大孔吸附樹脂

2.3.1.1 種類 具有大孔結(jié)構(gòu)的非極性大孔吸附樹脂可吸附極性較小的有機(jī)化合物［15］，本實(shí)驗(yàn)選擇常用型號(hào)（AB-8、D101、XAD1600、HP-20、HZ-801），檢測(cè)其吸附量、解吸率，結(jié)果見表5。最終，選擇D101 大孔吸附樹脂作進(jìn)一步分離純化工藝研究［16-17］。

表5 大孔吸附樹脂吸附量、解吸率測(cè)定結(jié)果Tab.5 Results of adsorption quantity and desorption rate determination of macroporous adsorption resins

2.3.1.2 層析柱徑高比 稱取預(yù)處理后的D101樹脂400 g，平均分為4 份，每份100 g，濕法裝柱。取4 份“2.3” 項(xiàng)下藥材粉末，加適量水制成0.2 g／mL 溶液，以1 BV／h 體積流量上樣，考察徑高比1∶3、1∶6、1∶10、1∶15 對(duì)沒食子酸、葡糖倍苷吸附率的影響，結(jié)果見圖3。由此可知，柱徑高比為1∶6 時(shí)2 種成分吸附率最高，故選擇其作進(jìn)一步研究。

圖3 徑高比對(duì)沒食子酸、葡糖倍苷吸附率的影響Fig.3 Effects of diameter-height ratio on the adsorption rates of gallic acid and glucogallin

2.3.2 上樣藥液

2.3.2.1 上樣質(zhì)量濃度 稱取預(yù)處理后的D101樹脂100 g，濕法裝柱，取“2.3” 項(xiàng)下藥材粉末，加適量水制成一定質(zhì)量濃度溶液，以1 BV／h 體積流量上樣，考察上樣質(zhì)量濃度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 g／mL 對(duì)沒食子酸、葡糖倍苷吸附率的影響，結(jié)果見圖4。由此可知，上樣質(zhì)量濃度為0.2 g／mL時(shí)2 種成分吸附率最高，故選擇其作進(jìn)一步研究。

圖4 上樣質(zhì)量濃度對(duì)沒食子酸、葡糖倍苷吸附率的影響Fig.4 Effects of sample concentration on the adsorption rates of gallic acid and glucogallin

2.3.2.2 上樣體積流量 取“2.3” 項(xiàng)下藥材粉末，加適量水制成0.2 g／mL 溶液，考察體積流量0.5、1、1.5、2、2.5 BV／h 對(duì)沒食子酸、葡糖倍苷吸附率的影響，結(jié)果見圖5。由此可知，上樣體積流量越小吸附越充分，但周期也隨之延長(zhǎng)，綜合考慮時(shí)間、吸附率，選擇1 BV／h作進(jìn)一步研究。

圖5 上樣體積流量對(duì)沒食子酸、葡糖倍苷吸附率的影響Fig.5 Effects of sample volumetric flow rate on the adsorption rates of gallic acid and glucogallin

2.3.3 洗脫工藝 本實(shí)驗(yàn)研究目的是確定合適的洗脫速率梯度，使水洗脫過程中水溶性雜質(zhì)與目標(biāo)部位達(dá)到良好的分離，并且目標(biāo)部位活性組分含有量符合相關(guān)要求。

2.3.3.1 洗脫體積流量 稱取預(yù)處理后的D101樹脂100 g，平行5 份，濕法裝柱，徑高比為1∶6。取上樣液80 mL（沒食子酸、葡糖倍苷總含有量為10.64%），400 mL 純化水以不同體積流量進(jìn)行洗脫，前1.5 BV 洗脫液棄去，收集第1.5～4 BV 洗脫液，濃縮干燥，測(cè)定2 種成分總含有量，結(jié)果見圖6。由此可知，洗脫體積流量越大，總含有量越低，但過大時(shí)水溶性雜質(zhì)與目標(biāo)組分不能得到很好的分離，從而影響終產(chǎn)品目標(biāo)組分含有量，最終確定為1.5 BV／h。

2.3.3.2 加水量 稱取預(yù)處理后的D101 樹脂500 g，濕法裝入層析柱中，取“2.3” 項(xiàng)下藥材粉末，配制成0.2 g／mL 藥液100 mL，以1 BV／h 體積流量通過層析柱，用水洗脫，每半個(gè)柱體積收集1 份，直至無目標(biāo)組分流出，再用50%、95%乙醇進(jìn)行洗脫，接收液分別濃縮、干燥后得到固體粉末，測(cè)定沒食子酸、葡糖倍苷總含有量，結(jié)果見圖7。由此可知，當(dāng)加水量達(dá)4 BV 時(shí)，目標(biāo)組分已基本上完全被洗脫。合并1.5～4 BV 洗脫液，濃縮干燥后測(cè)得2 種成分總含有量為57.9%，符合預(yù)定要求，故選擇4 BV 水洗脫比較合適（前1.5 倍柱體積所含目標(biāo)成分純度不高，棄去）。

圖6 洗脫體積流量對(duì)沒食子酸、葡糖倍苷總含有量的影響Fig.6 Effect of elution volumetric flow rate on the total content of gallic acid and glucogallin

圖7 加水量對(duì)沒食子酸、葡糖倍苷總含有量的影響Fig.7 Effect of water consumption on the total content of gallic acid and glucogallin

2.3.4 分離純化工藝確定 選用經(jīng)預(yù)處理的D101 樹脂，柱徑高比為1∶6，上樣質(zhì)量濃度為0.2 g／mL，上樣體積流量為1.5 BV／h，提取物用水溶解上柱，每500 g 樹脂先用750 mL（1.5 BV） 水洗脫除去部分非目標(biāo)雜質(zhì)，再用1 250 mL（1.5～4 BV） 水洗脫收集，濃縮干燥，得到余甘子總酚，其性狀為白色至淡黃色固體粉末，收率約為4.8%。

2.4 純化工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 通過3 批驗(yàn)證試驗(yàn)可知，余甘子總酚有效部位中沒食子酸、葡糖倍苷總含有量均在50%以上，見表6。

表6 純化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.6 Results of verification tests for purification process（n＝3）

3 討論與結(jié)論

根據(jù)《藥品注冊(cè)管理辦法》 的相關(guān)要求，中藥有效部位制劑定義為“未在國(guó)內(nèi)上市銷售的從植物、動(dòng)物、礦物等物質(zhì)中提取的有效部位及其制劑，其有效部位含量應(yīng)占提取物的50%以上”。為了提高有效部位原料的質(zhì)量可控性、安全性、有效性，本研究以HPLC 法測(cè)定已知結(jié)構(gòu)化合物含有量大于50%為目標(biāo)，發(fā)現(xiàn)相比于紫外色譜法，有效部位含有量的要求進(jìn)一步提高。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過篩選大孔吸附樹脂材料、優(yōu)化余甘子總酚提取純化工藝，結(jié)合多批中試驗(yàn)證，確定了抗痛風(fēng)中藥有效部位制備工藝路線及參數(shù)，并參考了中藥有效部位新藥注冊(cè)申請(qǐng)的相關(guān)要求。上述研究過程和思路具有一定的代表性，可為同類新藥制備工藝的開發(fā)提供參考和借鑒。