周 開 張佩琛 郝海軍 付金芳 范明松*

（1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 河南 鄭州450064； 2.上海雷允上藥業(yè)有限公司技術(shù)中心，上海201401）

蒙花苷是一種天然黃酮類化合物，主要存在于野菊花、密蒙花等植物中，具有降血壓、抗氧化、鎮(zhèn)痛、疏風(fēng)清熱、抗菌消炎、養(yǎng)肝明目等藥理作用［1-3］。近年來研究［4］發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞損傷導(dǎo)致的功能性障礙與高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病等多種心血管疾病密切相關(guān)，故預(yù)防和逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細胞損傷有望成為治療心腦血管疾病的新方法，而蒙花苷對血管內(nèi)皮細胞具有明顯的保護和修復(fù)作用［5-6］，有望開發(fā)成預(yù)防、治療心腦血管疾病的新藥。但該成分水溶性和脂溶性均較差［7］，導(dǎo)致體內(nèi)吸收困難。

納米給藥系統(tǒng)在促進難溶性藥物體內(nèi)吸收、提高生物利用度方面具有較大優(yōu)勢，但由于蒙花苷脂溶性較差，嚴重影響了它與納米脂質(zhì)載體的親和性，往往導(dǎo)致納米粒包封率較低［8］，故為了獲得高包封率的固體脂質(zhì)納米粒，需先改善藥物脂溶性。據(jù)報道，磷脂復(fù)合物技術(shù)有助于改善藥物脂溶性［8-10］，故本實驗采用溶劑揮發(fā)法制備蒙花苷磷脂復(fù)合物［11］，并進一步制成固體脂質(zhì)納米粒，再對其基本理化性質(zhì)及體內(nèi)藥動學(xué)進行研究。

1 材料

1.1 儀器 CPA255D型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；THZ-92A型恒溫振蕩器（上海翠柳實驗儀器有限公司）；DF-101S型磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；D8型X 射線粉末衍射儀（瑞士Bruker 公司）；ND200-2型氮氣吹掃儀（徐州晟浩電子科技有限公司）；XW-80A型漩渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

1.2 試劑與藥物 蒙花苷對照品（批號111528-201606，純度99.5%，中國食品藥品檢定研究院）。卵磷脂（批號PC98T，輔必成上海醫(yī)藥科技有限公司）；單硬脂酸甘油酯（批號T160522）、泊洛沙姆188（批號WPW1602B）（德國巴斯夫公司）?；前芳讗哼?qū)φ掌罚ㄅ朤20160615，純度＞99.0%，上海澤葉生物科技有限公司）。

1.3 動物 SD 大鼠，體質(zhì)量280～320 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，雌雄兼用，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬） 2012-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 蒙花苷固體脂質(zhì)納米粒制備 稱取蒙花苷21 mg、大豆磷脂29 mg、單硬脂酸甘油酯300 mg，溶于10 mL（60±1）℃無水乙醇中，作為有機相；將0.3 g 泊洛沙姆188 溶于同溫度30 mL 蒸餾水中，作為水相，1 000 r／min 轉(zhuǎn)速下將有機相滴入水相中，繼續(xù)攪拌0.5 h 得到初乳，置于超聲波細胞粉碎儀中超聲處理8 min（功率500 W，每超聲2 s間隔1 s），立即置于-20℃冰箱中固化，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得納米?；鞈乙?。

2.2 蒙花苷磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒制備 稱取蒙花苷60 mg、大豆卵磷脂80 mg，置于30 mL四氫呋喃中（1∶1），1 000 r／min 轉(zhuǎn)速下恒溫（45℃） 攪拌5 h，減壓旋蒸除去四氫呋喃，得到磷脂復(fù)合物［11］。采用乳化超聲分散法制備固體脂質(zhì)納米粒，稱取磷脂復(fù)合物50 mg、單硬脂酸甘油酯300 mg，溶于10 mL（60±1）℃無水乙醇中，作為有機相；將0.3 g 泊洛沙姆188 溶于同溫度30 mL蒸餾水中，作為水相，1 000 r／min 轉(zhuǎn)速下將有機相滴入水相中，繼續(xù)攪拌0.5 h 得到初乳，置于超聲波細胞粉碎儀中超聲處理8 min（功率500 W，每超聲2 s 間隔2 s），立即置于-20℃冰箱中固化，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得納米?；鞈乙?。

2.3 蒙花苷含有量測定

2.3.1 色譜條件 Waters C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.4% 磷酸（55∶45）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30℃；檢測波長325 nm；進樣量20 μL。

2.3.2 供試品溶液制備 精密量取0.5 mL 蒙花苷磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?，加入0.5 mL甲醇超聲處理后定容至10 mL，12 000 r／min 離心10 min，精密量取1 mL 至100 mL 量瓶中，流動相定容至刻度，HPLC 法測定蒙花苷總含有量。同法配制空白溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察 稱取蒙花苷對照品18.0 mg 溶于100.0 mL 甲醇中，得到0.18 mg／mL 貯備液，精密量取5 mL 于100 mL 量瓶中，流動相定容至刻度，即得（9.0 μg／mL），精密量取1.0 mL 于10 mL 量瓶中，流動相定容至刻度，即得（0.9 μg／mL），再進一步稀釋成 0.01、0.2，0.3、0.45、0.6、0.9 μg／mL，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進行回歸，得方程為Y＝13.575 6X＋2.041 9（r＝0.999 7），在0.01～0.9 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

取“2.3.2” 項下供試品溶液，于0、4、6、8、12、24 h 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得蒙花苷含有量的RSD 為0.48%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取0.01、0.6、0.9 μg／mL 對照品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定6次，測得日內(nèi)精密度RSD 分別為1.31%、0.27%、0.08%，表明該方法精密度良好。于空白溶液中分別加入0.45 μg／mL對照品溶液 0.8、1.0、1.2 mL，平行3 份，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得平均加樣回收率為100.92%，RSD為1.74%。

2.4 參數(shù)測定

2.4.1 包封率、載藥量 采用超濾離心法。精密量取1.0 mL 納米?；鞈乙河诔瑸V離心管中，12 000 r／min離心60 min。精密量取0.5 mL 續(xù)濾液，加入0.5 mL 甲醇超聲處理，定容至10 mL，精密量取1 mL 至100 mL 量瓶中，流動相定容至刻度，HPLC 法測定外管續(xù)濾液中蒙花苷含有量（m游離）；精密量取0.5 mL 蒙花苷磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?，加入0.5 mL 甲醇超聲處理，定容至10 mL，12 000 r／min 離心10 min，精密量取1 mL 至100 mL 量瓶中，流動相定容至刻度，HPLC 法測定蒙花苷總含有量，計算包封率、載藥量，公式分別為包封率＝［（m總藥-m游離藥） ／m總藥］×100%、載藥量＝［（m總藥-m游離藥） ／m藥脂］×100%，其中m總藥表示總藥物量，m游離藥表示游離藥物量，m藥脂表示藥物和脂質(zhì)總量。結(jié)果，磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒平均包封率為82.06%，載藥量為4.72%，高于固體脂質(zhì)納米粒的52.63%、2.93%，故選擇前者作進一步研究。

2.4.2 粒徑、Zeta 電位 量取蒙花苷磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒0.2 mL，加入4.0 mL 蒸餾水，振蕩混勻后測定粒徑、Zeta 電位，結(jié)果見圖1～2，可知平均粒徑為（216.72±3.57） nm，PDI 為0.067±0.09，Zeta 電位為（-8.7±0.7） mV。

圖1 蒙花苷磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of the solid lipid nanoparticles of buddleoside phospholipid complex

2.4.3 形態(tài) 量取蒙花苷磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒混懸液適量，按照1∶20 比例用蒸餾水稀釋后滴加到有支持膜的銅網(wǎng)上，均勻鋪展放置10 min，濾紙輕輕吸干，置于5%磷鎢酸溶液中浸泡5 min，自然晾干后在透射電鏡下觀察形態(tài)，結(jié)果見圖3。由此可知，納米粒呈類球形或球形，無粘連現(xiàn)象。

圖2 蒙花苷磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒Zeta 電位Fig.2 Zeta potential of the solid lipid nanoparticles of buddleoside phospholipid complex

圖3 蒙花苷磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscope image for the solid lipid nanoparticles of buddleoside phospholipid complex

2.5 體外穩(wěn)定性研究 于0、0.5、1、2、4、6、12、24、36、48 h 測定蒙花苷磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米?；鞈乙毫阶兓Y(jié)果見圖4。由此可知，納米粒在48 h 內(nèi)粒徑變化不顯著，可能與靜電排斥力有關(guān)；磷脂復(fù)合物在0.5 h 內(nèi)即發(fā)生沉淀，可能是由于它一般在非質(zhì)子溶劑中制備，當(dāng)接觸水相時即發(fā)生解離而沉淀。

圖4 蒙花苷磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒體外穩(wěn)定性Fig.4 In vitro stability of the solid lipid nanoparticles of buddleoside phospholipid complex

2.6 凍干粉制備 量取2 mL 蒙花苷磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米?；鞈乙河谖髁制恐?，加入5%甘露醇混勻，置于-75℃冰箱中預(yù)凍12 h 后立即放入-40℃凍干機中，平衡3 h 后抽真空，4℃／h升溫至-25℃，保持48 h，即得。取適量加水重新分散，測得其平均粒徑為（252.31±6.11） nm，Zeta電位為（-7.9±0.8） mV，與固體脂質(zhì)納米?；鞈乙合啾?，前者有所增大，而后者有所下降。

2.7 體內(nèi)藥動學(xué)研究

2.7.1 灌胃液制備 取蒙花苷、蒙花苷磷脂復(fù)合物、蒙花苷磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒凍干粉末適量，0.5% CMC-Na 配制成5 mg／mL（以蒙花苷含有量計），即得。

2.7.2 給藥方案及采血 取SD 大鼠18 只，雌雄兼具，隨機分為蒙花苷組、蒙花苷磷脂復(fù)合物組、蒙花苷磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒組，每組大鼠按40 mg／kg 劑量（以蒙花苷含有量計） 分別灌胃給予“2.7.1” 項下相應(yīng)灌胃液。大鼠固定于37℃保溫墊上行頸動脈插管術(shù)，于5、10、30、45、60、90、120、150、180、240、360 min 各取血0.2 mL至肝素化離心管中，2 500 r／min 離心3 min，取上層血漿冷凍待測。

2.7.3 血樣處理 精密量取磺胺甲惡唑（內(nèi)標(biāo)）溶液（228.4 ng／mL） 20 μL、血漿樣品50 μL，置于離心管中，加入1.5 mL 甲醇后渦旋混勻6 min，8 000 r／min 離心30 min，分取上清液，45℃下氮氣緩慢吹除有機溶劑，加入50 μL 甲醇復(fù)溶，8 000 r／min 離心10 min，取上清液，置于進樣瓶的內(nèi)襯管中待測。

2.7.4 專屬性、線性關(guān)系考察 將空白血漿在室溫下解凍，按“2.7.3” 項下方法處理（不加內(nèi)標(biāo)），同法處理給藥后血漿。另取血漿對照品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得蒙花苷、磺胺甲惡唑（內(nèi)標(biāo)） 分別在5.9、6.3 min出峰，而且均不受內(nèi)源性物質(zhì)干擾。

精密稱取磺胺甲惡唑?qū)φ掌?2.84 mg，溶于100 mL 甲醇中，得到228.4 μg／mL 貯備液，取適量繼續(xù)稀釋至228.4 ng／mL，作為內(nèi)標(biāo)溶液。精密稱取蒙花苷對照品22.60 mg，溶于100.0 mL 甲醇中，甲醇逐步稀釋成1 130.0、565.0、282.5、113.0、56.5、28.2 ng／mL，分別量取50 μL，氮氣吹干后加入同體積空白血漿，混勻溶解，得到血漿對照品溶液，按“2.7.3” 項下方法處理，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定。以蒙花苷與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進行回歸，得方程為Y＝1.307 2X＋8.915 3（r＝0.991 3），在28.2～1 130.0 ng／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.5 方法學(xué)考察 取28.2、565.0、1 130 ng／mL血漿對照品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得日內(nèi)精密度RSD 分別為8.26%、4.83%、4.11%，日間精密度RSD 分別為10.64%、7.62%、6.23%，表明該方法精密度良好。任取一份血漿樣品，于0、2、4、8、12、24、48 h 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得蒙花苷、內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD 為1.92%，表明血漿樣品在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密稱取蒙花苷對照品16.00 mg，溶于100.0 mL 甲醇中得160.00 μg／mL 溶液，精密量取1.0 mL 至 100 mL 量瓶中，甲醇定容至1 600 ng／mL，繼續(xù)用甲醇稀釋至40.0、400.0、800.0 ng／mL，分別精密量取50 μL，氮氣吹干，加入同體積大 鼠空白血漿，得 40.0、400.0、800.0 ng／mL血漿樣品，按“2.7.3” 項下方法處理，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得回收率分別為92.34%、96.17%、94.72%，RSD 均小于1.84%。將25.75 ng／mL 血漿對照品溶液逐步稀釋，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得定量限（信噪比約為10） 為6.38 ng／mL，檢測限（信噪比約為3） 為2.12 ng／mL。

2.7.6 分析結(jié)果 圖5、表1 顯示，與蒙花苷比較，其磷脂復(fù)合 物Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升 高（P＜0.05）；與蒙花苷及其磷脂復(fù)合物比較，其固體脂質(zhì)納米粒tmax延長（P＜0.05），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.05，P＜0.01）。另外，磷脂復(fù)合物、固體脂質(zhì)納米粒相對生物利用度較原料藥分別提高至1.39、2.89 倍。

圖5 樣品血藥濃度-時間曲線Fig.5 Plasma concentration-time curves for samples

3 討論

藥物親脂性對固體脂質(zhì)納米粒包封率的影響較大［9］，課題組前期對蒙花苷固體脂質(zhì)納米粒進行了研究，發(fā)現(xiàn)其包封率僅為52.63%；本實驗將該成分先制成磷脂復(fù)合物以提高其脂溶性，增加與脂質(zhì)載體的親和性，再進一步制成固體脂質(zhì)納米粒，此時包封率提高至82.06%。

表1 樣品主要藥動學(xué)參數(shù)（， n＝6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for samples（， n＝6）

表1 樣品主要藥動學(xué)參數(shù)（， n＝6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for samples（， n＝6）

注：與蒙花苷比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與蒙花苷磷脂復(fù)合物比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

為防止SD 大鼠處于失血性病理狀態(tài)，藥動學(xué)研究中對其進行頸動脈插管術(shù)，可最大程度減少采血時血量的損失，也可防止眼眶靜脈叢采血時帶來的時間誤差，可控性較強；另一方面，該方法可使大鼠在實驗過程中自由飲水。結(jié)果顯示，磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒可顯著升高蒙花苷Cmax，促進該成分在機體內(nèi)的吸收，相對生物利用度提高至2.89 倍；顯著延長tmax，可能是由于固體脂質(zhì)納米粒對包裹于其中的藥物具有緩釋作用［8］，有助于增加藥物體內(nèi)滯留時間，促進其體內(nèi)吸收，而且納米粒處方中磷脂、泊洛沙姆本身也具有促進藥物體內(nèi)吸收的作用［12-14］；tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞與磷脂復(fù)合物相比均有顯著差異，表明固體脂質(zhì)納米粒后能改變磷脂復(fù)合物藥動學(xué)，更有助于促進藥物體內(nèi)吸收。

綜上所述，本實驗成功制備了蒙花苷磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒，為制備高包封率的相關(guān)劑型提供了借鑒，也為進一步研究其體內(nèi)藥效學(xué)［15-16］奠定了基礎(chǔ)。