1 材料與方法

1.1 受試藥物

應(yīng)激寧，批號(hào)：20190725，由武漢華揚(yáng)動(dòng)物藥業(yè)有限責(zé)任公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡清潔級(jí)Wistar大鼠80只，雌雄各半，體重公鼠在130～150g之間，母鼠在120～140g之間，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2012-0004，使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2012-0029。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將80只Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，分別為應(yīng)激寧高、中、低劑量組和空白對(duì)照組，每組20只，雌雄各半。組內(nèi)動(dòng)物個(gè)體體重相差應(yīng)不超過平均體重的20%，組間平均體重相差不超過5%。

1.4 給藥劑量及給藥途徑

由于急毒試驗(yàn)沒有測出LD50，90d喂養(yǎng)試驗(yàn)的高劑量組按最大耐受劑量10g/Kg（根據(jù)90d喂養(yǎng)試驗(yàn)指導(dǎo)原則確定為靶動(dòng)物攝入量的100倍，靶動(dòng)物推薦的攝入量為100mg/kg，試驗(yàn)大鼠即100mg/Kg×100=10g/Kg），混飼給藥，分為低，中，高劑量組及對(duì)照組。給藥各組劑量分別定為：0.0g/KgBW，2.5g/KgBW，5.0g/KgBW，10g/KgBW，連續(xù)給藥90d。

期間受試藥物給予量按大鼠每日飼料攝入量折算為飼料中受試藥物濃度。因此在喂養(yǎng)試驗(yàn)的前30d大鼠每日飼料攝入按體重的10%折算，即將應(yīng)激寧分別按2.5%、5.0%和10.0%的濃度添加于由比較醫(yī)學(xué)中心提供的大鼠全價(jià)飼料的原粉料中，經(jīng)充分混勻后熱擠壓制成顆粒料喂養(yǎng)。在喂養(yǎng)試驗(yàn)的后60d大鼠每日飼料攝入按體重的8%折算，即將應(yīng)激寧分別按3.125%、6.25%和12.5%的濃度添加于大鼠全價(jià)飼料的原粉料中，經(jīng)充分混勻后熱擠壓制成顆粒料供喂養(yǎng)。（注計(jì)算說明：高劑量組，大鼠1Kg的每日飼料攝入量為1,000g×10%＝100g，大鼠1Kg應(yīng)給予的應(yīng)激寧劑量為10g，即1Kg大鼠每日攝入的100g飼料中應(yīng)添加應(yīng)激寧10g。因此，折算成濃度百分比為10%，其他劑量類推。）

1.5 試驗(yàn)期間臨床觀察

服藥期間每天肉眼觀察大鼠的一般行為（包括精神狀態(tài)，行為活動(dòng)，采食量，飲水量，毛色，對(duì)外反應(yīng)，糞便等）、中毒及死亡情況；同時(shí)記錄飲水量、采食量，并按周測量大鼠體重，投入飼料量和剩余飼料量。并計(jì)算平均攝食量、增重。將染毒劑量組與對(duì)照組加以比較和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，及時(shí)記錄和分析大鼠的中毒癥狀及出現(xiàn)各癥狀的先后次序、時(shí)間。

1.6 血液學(xué)和血液生化檢測

在給藥45d和90d結(jié)束時(shí)，各組隨機(jī)抽取10只大鼠（雌、雄各半）采血進(jìn)行血液學(xué)指標(biāo)檢測（包括血紅蛋白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類等）和血液生化指標(biāo)檢測（包括谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST或SGOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT或SGPT）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、血糖（GLu）、血清白蛋白（Alb）、總蛋白（TP）、總膽固醇（TCH）和甘油三脂（TG）等）。

表1 對(duì)大鼠體重的影響（n=10）

1.7 病理檢查

1.7.1 大體剖檢

于給藥45d和90d試驗(yàn)結(jié)束，各組分別取10只大鼠（雌、雄各半）進(jìn)行剖檢（可結(jié)合采血進(jìn)行）。做好記錄，并將重要器官和組織固定保存。

1.7.2 臟器稱重

剖檢試驗(yàn)大鼠的同時(shí)，稱取大鼠體重及各主要臟器（包括肝、肺、心、腎、脾、胃腸、睪丸/子宮等）重量，計(jì)算各臟器系數(shù)。

1.7.3 組織病理學(xué)檢查

對(duì)高劑量組及對(duì)照組大鼠的主要臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)病變后再對(duì)較低劑量組大鼠的相應(yīng)器官及組織進(jìn)行檢查。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

各組大鼠拌飼給藥直至90d，均無死亡，期間精神、活動(dòng)，采食行為、飲水行為、毛色、對(duì)外反應(yīng)和糞便等臨床表現(xiàn)正常，沒有出現(xiàn)病理狀態(tài)和死亡。

2.2 對(duì)大鼠體重的影響

試驗(yàn)期間，每周對(duì)各組大鼠稱重1次，統(tǒng)計(jì)周平均體重和周增重率。結(jié)果第1周高劑量組母鼠的周均增重率顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），其余各周各給藥組母鼠的均重和周均增重率與空白對(duì)照組均無顯著差異；第1～7周各給藥組公鼠的均重都顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），第8～12周部分給藥組公鼠的均重仍顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），但各給藥組公鼠的周均增重率只有第1、2周顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），而第3周后各給藥組公鼠的周均增重率與空白對(duì)照組均無顯著差異，甚至有許多周還高于空白對(duì)照組的周均增重率，詳細(xì)結(jié)果見表1。引起這現(xiàn)象的原因是由于給各藥組所給藥物應(yīng)激寧分別達(dá)到了飼料含量的2.5%、5.0%和10.0%（指導(dǎo)原則要求高劑量組應(yīng)為靶動(dòng)物攝入量的100倍），從而一定程度上降低了飼料的能量、蛋白質(zhì)和其他營養(yǎng)物質(zhì)的含量和影響了適口性，因而造成飼料攝入量應(yīng)該較多的公鼠在給藥早期（第1、2周）采食量相對(duì)減少，體重增加亦較少。另外，從整個(gè)給藥試驗(yàn)的前45d、后45d及90d的周均增重率來比較，所有試驗(yàn)給藥的高、中、低劑量公、母鼠各組與空白對(duì)照組均無顯著差異，說明在大鼠適應(yīng)含藥飼料后，應(yīng)激寧對(duì)大鼠體增重沒有大的影響。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各試驗(yàn)組公鼠的平均體重均比空白對(duì)照組低近30g，因?yàn)楦鹘M內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差比較大，只有中劑量組的均重顯著低于空白組（P＜0.05），低劑量組和高劑量組與空白組差異不顯著。造成體重差異的原因，還是與各試驗(yàn)組公鼠的采食量比空白組低有關(guān)，整個(gè)試驗(yàn)期間空白組、低劑量組、中劑量組和高劑量組采食量分別為1,271.69g、1,124.76g、1,153.04g、1,199g，低劑量組的采食量最低，比空白組低近147g，同時(shí)添加中藥后飼料的能量和蛋白質(zhì)含量相應(yīng)降低，導(dǎo)致各試驗(yàn)組大鼠試驗(yàn)結(jié)束后體重比空白組低很多；因?yàn)樘砑痈嗟闹兴幹袆┝拷M和高劑量組飼料的能量和蛋白質(zhì)比低劑量組的更低，但是這兩組的采食量比低劑量的高、高劑量組的采食量比中劑量組的高，所以這三組的增重比較接近。

表2 對(duì)大鼠采食量、飲水量的影響（n=10）

表3 連續(xù)投喂45d對(duì)Wistar大鼠血液學(xué)及血液生化參數(shù)的影響（n=10）

2.3 對(duì)大鼠采食量和飲水量的影響

試驗(yàn)期間對(duì)各組大鼠的采食量和飲水量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示：除第1周各給藥組公鼠的采食量顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05，這與大鼠對(duì)含藥飼料的適應(yīng)性有關(guān)），各給藥組母鼠的采食量略低于空白對(duì)照組外，其余各周各給藥組公母鼠的采食量和飲水量與空白對(duì)照組相比均無顯著差異（P＞0.05），詳細(xì)結(jié)果見表2。說明在大鼠適應(yīng)含藥飼料后，應(yīng)激寧對(duì)大鼠的采食量和飲水量沒有明顯影響。

表4 連續(xù)投喂90d對(duì)Wistar大鼠血液學(xué)及血液生化參數(shù)的影響（n=10）

2.4 對(duì)大鼠血常規(guī)和血液生化指標(biāo)的影響

連續(xù)給藥45d和90d后，對(duì)各組一半大鼠的血液學(xué)指標(biāo)和血液生化指標(biāo)分別進(jìn)行了檢測統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示：各劑量組的血液學(xué)指標(biāo)和血液生化指標(biāo)測定值與對(duì)照組相比均無顯著性差異（P＞0.05），詳細(xì)結(jié)果見表3、表4。說明應(yīng)激寧按高、中、低劑量混飼連續(xù)給藥90d，對(duì)大鼠血常規(guī)和血液生化指標(biāo)未造成影響。

2.5 對(duì)大鼠主要臟器系數(shù)的影響

連續(xù)給藥45d和90d后，各組分別取一半大鼠撲殺，剖檢觀察、稱量主要臟器，統(tǒng)計(jì)分析各臟器系數(shù)。結(jié)果顯示：所有給藥組的各器官臟器系數(shù)與空白對(duì)照組相比均無顯著差異（P＞0.05），詳細(xì)結(jié)果見表5。說明應(yīng)激寧按高、中、低劑量混飼連續(xù)給藥90d，對(duì)大鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、睪丸/卵巢子宮的生長發(fā)育均沒有影響。

2.6 對(duì)重要器官組織的病理影響

連續(xù)給藥45d和90d后，各組分別取一半大鼠采血后撲殺，肉眼觀察各組大鼠主要內(nèi)臟器官，結(jié)果顯示：給藥的各劑量組和空白對(duì)照組大鼠的臟器均未發(fā)現(xiàn)異常病變。然后分別采集空白對(duì)照組和高劑量組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃腸、睪丸或子宮組織用10%福爾馬林溶液固定，制作石蠟組織切片，經(jīng)HE染色，顯微鏡觀察，亦未發(fā)現(xiàn)異常的組織病理學(xué)變化，詳見附圖。

3 結(jié)果分析

連續(xù)給藥90d應(yīng)激寧各劑量組大鼠的增重率、攝食、血常規(guī)及血液生化指標(biāo)與對(duì)照組相比，均未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）；剖檢和組織學(xué)觀察肝、腎、心、脾、肺、睪丸或子宮等重要器官組織均未發(fā)現(xiàn)異常的組織病理學(xué)變化。

4 結(jié)論

在試驗(yàn)條件下，未發(fā)現(xiàn)應(yīng)激寧對(duì)大鼠的生長發(fā)育產(chǎn)生不良影響，90d連續(xù)給藥無亞慢性毒性。體重的差異與采食量和攝入的能量及營養(yǎng)物質(zhì)含量下降有關(guān)。

表5 對(duì)大鼠主要臟器系數(shù)的影響（n=10）