劉德坤，吳夢(mèng)琪，許柏林，陳英豪，夏柏玉，吳佳文

（1. 句容市后白鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，江蘇句容 212444；2. 句容市后白鎮(zhèn)農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)監(jiān)督站 江蘇句容 212444；3. 江蘇省植物保護(hù)植物檢疫站，南京 210036）

吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）是德國(guó)巴斯夫公司開發(fā)的一種新型甲氧基丙烯酸酯類廣譜殺菌劑，通過(guò)阻止細(xì)胞色素b和c1復(fù)合體的電子傳遞來(lái)抑制線粒體呼吸作用，導(dǎo)致病原菌衰亡。二氰蒽醌（dithianon）是德國(guó)默克公司開發(fā)的保護(hù)性殺菌劑，主要通過(guò)抑制孢子萌發(fā)達(dá)到保護(hù)效果，可防治多種真菌性病害。兩者復(fù)配使用保護(hù)性更好，持效期更長(zhǎng)，藥效顯著。田間藥效試驗(yàn)結(jié)果表明16%二氰·吡唑酯水分散粒劑對(duì)蘋果、香蕉、柑橘等多種作物的炭疽病防效較好[1-3]。但有關(guān)16%二氰·吡唑酯水分散粒劑的質(zhì)量檢測(cè)分析方法，目前尚未見(jiàn)公開報(bào)道。本文采用高效液相色譜法（HPLC），在同一液相色譜條件下，一次進(jìn)樣同時(shí)定量分析制劑中兩種有效成分含量，并對(duì)懸浮率和熱貯穩(wěn)定性等多種質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定方法進(jìn)行探索，為企業(yè)生產(chǎn)16%二氰·吡唑酯水分散粒劑過(guò)程中的質(zhì)量控制和質(zhì)檢機(jī)構(gòu)的質(zhì)量檢測(cè)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙腈，色譜純；水，二次蒸餾水；磷酸，分析純；二氰蒽醌原藥（98%），河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司；吡唑醚菌酯原藥（98%），德國(guó)巴斯夫公司；16%二氰·吡唑酯水分散粒劑，實(shí)驗(yàn)室自制；Acme9000高效液相色譜（具可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器），韓國(guó)英麟機(jī)器有限公司；UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津公司。

1.2 有效成分含量檢測(cè)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Amethyst C18-H（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；流動(dòng)相：乙腈＋0.02%磷酸水溶液（體積比80∶20）；檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm；柱溫：23～27℃；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。保留時(shí)間：二氰蒽醌約5.3 min；吡唑醚菌酯約7.4 min。

1.2.2 溶液的配制

標(biāo)樣：分別準(zhǔn)確稱取約0.102 g二氰蒽醌標(biāo)樣和吡唑醚菌酯標(biāo)樣（精確至0.000 2 g），置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，可分別得到1.0g/L的二氰蒽醌、吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL上述溶液加入到10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，充分搖勻，分別得到0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L的二氰蒽醌、吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液。用0.22 μm濾膜過(guò)濾，備用。

試樣：準(zhǔn)確稱量0.300 0 g 16%二氰·吡唑酯水分散粒劑（精確至0.000 2 g），放入50 mL容量瓶中，添加少許乙腈超聲振蕩5 min，使其溶解完全，冷卻至室溫后，乙腈定容至刻度，搖勻。量取10 mL上述溶液，置于25 mL容量瓶中，乙腈定容，搖勻后，過(guò)0.22 μm濾膜備用。

1.2.3 有效成分含量的測(cè)定

在上述色譜條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2針中二氰蒽醌（吡唑醚菌酯）峰面積相對(duì)變化不大于1.0%，按照標(biāo)樣、試樣、試樣、標(biāo)樣順序進(jìn)行測(cè)定。

將測(cè)得的試樣溶液和標(biāo)樣溶液中二氰蒽醌和吡唑醚菌酯的峰面積分別平均后，按式（1）計(jì)算有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w。

式中：A1、A2為標(biāo)樣、試樣溶液中二氰蒽醌（吡唑醚菌酯）峰面積的平均值；m1為試樣的質(zhì)量，g；m2為二氰蒽醌（吡唑醚菌酯）標(biāo)樣的質(zhì)量，g；P為二氰蒽醌（吡唑醚菌酯）標(biāo)樣中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.3 懸浮率的檢測(cè)方法

1.3.1 樣品懸浮率的檢測(cè)方法

參考GB/T 14825—2006《農(nóng)藥懸浮率測(cè)定方法》，準(zhǔn)確稱取1.0 g試樣（精確至0.000 2 g），倒入含有100 mL標(biāo)準(zhǔn)硬水（30±2℃）的250 mL具塞量筒中，加入標(biāo)準(zhǔn)硬水定容至250 mL，擰緊塞子，在1 min內(nèi)上下顛倒30次。打開塞子，恒溫水浴30 min后，輕輕取出量筒，在10～15 s內(nèi)，利用虹吸原理移出225 mL的懸浮液，將量筒底部25 mL懸浮液移至培養(yǎng)皿，干燥至衡重，用50 mL乙腈分多次沖洗后定容，用1.2.3中方法測(cè)定殘余物有效成分含量。按式（2）計(jì)算懸浮率。

式中：M1為配制懸浮液所取樣品中有效成分質(zhì)量，g；M2為量筒底部25 mL懸浮液中有效成分的質(zhì)量，g；S為懸浮率，%。

1.3.2 懸浮率檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和精密度

稱取0.4 g 16%二氰·吡唑酯水分散粒劑樣品（精確至0.000 2 g）至燒杯中，加入25 mL標(biāo)準(zhǔn)硬水，用玻璃棒攪拌均勻，（30±1）℃水浴中靜置4 min，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，干燥至衡重，用100 mL乙腈分多次沖洗后定容，用1.2.3中方法測(cè)定殘余物及樣品中有效成分含量，計(jì)算回收率；據(jù)1.3.1中方法連續(xù)測(cè)定16%二氰·吡唑酯水分散粒劑樣品懸浮率，計(jì)算方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 熱貯穩(wěn)定性的檢測(cè)方法

取16%二氰·吡唑酯水分散粒劑樣品10 g，密封于鋁箔袋中，在52～56℃的恒溫烘箱中貯存14 d后，取出樣品，冷卻至室溫后測(cè)定其有效成分含量及懸浮率。有效成分分解率不大于5%，樣品懸浮率不小于80%，視為熱貯合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在250～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，得相應(yīng)的吸收波長(zhǎng)與響應(yīng)值的紫外吸收光譜圖。結(jié)果顯示，300 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，二氰蒽醌有最大吸收峰，吡唑醚菌酯也有較強(qiáng)吸收峰，且兩峰大小比例適當(dāng)，雜質(zhì)響應(yīng)值小，流動(dòng)相無(wú)吸收，最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

為確保二氰蒽醌和吡唑醚菌酯與雜質(zhì)完全分離，參考不同文獻(xiàn)[4-6]先后選用不同比例的甲醇-乙腈-水，甲醇-水，以及乙腈-水作為流動(dòng)相對(duì)試樣進(jìn)行分離檢測(cè)，結(jié)果表明當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-水（體積比80∶20），含0.02%磷酸時(shí)，各組分均得到理想的分離，且峰形對(duì)稱，出峰時(shí)間短，基線平穩(wěn)。

2.2 有效成分含量的檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 分析方法的線性關(guān)系

取1.2.2中配置的二氰蒽醌（吡唑醚菌酯）標(biāo)樣溶液，按上述色譜操作條件，測(cè)定相應(yīng)響應(yīng)值，并以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到二氰蒽醌標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度與峰面積的線性回歸方程為y二氰蒽醌=14 881x＋9.663 6，其線性相關(guān)系數(shù)為R二氰蒽醌=0.999 9；吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度與峰面積的線性回歸方程為y吡唑醚菌酯=22 598x＋34.636，其線性相關(guān)系數(shù)為R吡唑醚菌酯=0.999 7，該結(jié)果表明二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在0.05～0.6 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 分析方法的精密度

在上述色譜操作條件下，對(duì)同一16%二氰·吡唑酯水分散粒劑有效成分含量平行測(cè)定5次。二氰蒽醌、吡唑醚菌酯的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.095和0.085，變異系數(shù)分別為0.77%和2.00%。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 有效成分分析方法的精確度測(cè)定

2.2.3 分析方法的準(zhǔn)確度

為了驗(yàn)證16%二氰·吡唑酯水分散粒劑有效成分含量分析方法的準(zhǔn)確性，制備了不含原藥的空白水分散粒劑樣品。稱取100 mg空白水分散粒劑樣品15份，分為3組，分別向每組5份樣品中加入已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的二氰蒽醌和吡唑醚菌酯，按照1.3.2的樣品溶液配制方法處理后進(jìn)行分析，測(cè)定添加回收率。由表2可知，二氰蒽醌添加回收率在99.27%～100.88%，平均回收率為100.05%；吡唑醚菌酯添加回收率為98.83%～101.66%，平均回收率為99.90%。該方法準(zhǔn)確度較高，可準(zhǔn)確定量。

表2 有效成分分析方法的準(zhǔn)確度測(cè)定

2.2.4 樣品有效成分含量的測(cè)定

在上述選定的HPLC分析條件下，對(duì)樣品中二氰蒽醌和吡唑醚菌酯有效成分含量進(jìn)行測(cè)定，圖1表明，兩種有效成分與雜質(zhì)峰分離完全，無(wú)相互干擾。經(jīng)測(cè)定二氰蒽醌、吡唑醚菌酯保留時(shí)間分別為5.282 min、7.332 min。對(duì)16%二氰·吡唑酯水分散粒劑樣品中有效成分含量進(jìn)行計(jì)算，得出二氰蒽醌含量為12.24%，吡唑醚菌酯含量為4.13%。

圖1 16%二氰·吡唑酯水分散粒劑HPLC 譜圖

2.3 懸浮率測(cè)定方法的分析

懸浮率決定了水分散粒劑制劑在水中崩解、分散后能否形成穩(wěn)定、均一的懸浮體系，是水分散粒劑中有效成分發(fā)揮藥效的重要保障[7-8]。表3、4的結(jié)果表明：按照懸浮率測(cè)定方法，二氰蒽醌回收率為99.27%～100.65%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.776，變異系數(shù)為0.807%；吡唑醚菌酯回收率為98.08%～101.18%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.536，變異系數(shù)為0.578%。按照1.3.1中方法對(duì)16%二氰·吡唑酯水分散粒劑樣品進(jìn)行測(cè)定，二氰蒽醌的懸浮率為96.36%，吡唑醚菌酯懸浮率為93.04%。制劑懸浮率符合水分散粒劑標(biāo)準(zhǔn)。

表3 懸浮率分析方法準(zhǔn)確度測(cè)定

表4 懸浮率分析方法的精密度測(cè)定

2.4 熱貯穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

熱貯穩(wěn)定性是水分散粒劑的一個(gè)重要指標(biāo)，也是產(chǎn)品能否長(zhǎng)期穩(wěn)定保存的重要指標(biāo)[6-7]。16%二氰·吡唑酯水分散粒劑熱貯穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 16%二氰·吡唑酯水分散粒劑熱貯穩(wěn)定性測(cè)定

從表5中可以看出：16%二氰·吡唑酯水分散粒劑中兩種有效成分化學(xué)穩(wěn)定性較好，在52～56℃熱貯14 d后，二氰蒽醌的平均分解率僅為0.31%，吡唑醚菌酯的平均分解率僅為1.59%。熱貯前后，樣品的懸浮率均大于等于90%，符合相關(guān)指標(biāo)，說(shuō)明該配方中助劑配伍合理，制劑性能穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法檢測(cè)16%二氰·吡唑酯水分散粒劑有效成分，并測(cè)定制劑懸浮率、熱貯穩(wěn)定性等主要指標(biāo)。同時(shí)定量分析二氰蒽醌、吡唑醚菌酯2種有效成分，簡(jiǎn)便、快速，分離充分，條件穩(wěn)定，是一種較為理想的液相色譜分析條件；懸浮率測(cè)定方法的研究表明，此方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，是一種簡(jiǎn)便可行、較為理想的分析方法。測(cè)定分析結(jié)果表明，16%二氰·吡唑酯水分散粒劑樣品懸浮率高、有效成分含量達(dá)標(biāo)、熱貯穩(wěn)定性好，均能達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，適用于此制劑質(zhì)量控制的檢測(cè)。