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        蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)(Nosema locustae)對(duì)環(huán)境非靶標(biāo)有益生物的毒性效應(yīng)

        2020-07-08 05:44:38袁善奎蔣金花吳聲敢柳新菊安雪花
        現(xiàn)代農(nóng)藥 2020年3期
        關(guān)鍵詞:懸浮劑

        袁善奎,蔣金花,張 龍,吳聲敢,柳新菊,安雪花,李 崗

        (1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所,北京 100125;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所,杭州 310021;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),北京 100193)

        隨著化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境污染問(wèn)題的日益凸顯,微生物農(nóng)藥以其選擇性強(qiáng)、來(lái)源廣泛、對(duì)人畜低毒、不易產(chǎn)生抗性、能兼顧生態(tài)平衡等優(yōu)勢(shì)受到了越來(lái)越多的關(guān)注。微生物農(nóng)藥主要是指用于防治危害農(nóng)作物的病、蟲(chóng)、草、鼠害及促進(jìn)作物生長(zhǎng)的活體微生物[1],主要包括細(xì)菌、真菌、病毒、線蟲(chóng)及原生動(dòng)物等[2-3]。其中可利用的原生動(dòng)物類微生物農(nóng)藥主要為微孢子蟲(chóng),約有200種,常用的有蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)、玉米螟微孢子蟲(chóng)和樅色卷葉蛾微孢子蟲(chóng)等。此類農(nóng)藥在防治棉鈴蟲(chóng)、蝗蟲(chóng)、松毛蟲(chóng)上均有應(yīng)用?;认x(chóng)微孢子蟲(chóng)(Nosema locustae)是蝗蟲(chóng)等直翅目昆蟲(chóng)的專性寄生的單細(xì)胞真核原生動(dòng)物,由Canning[4]于1953年從非洲飛蝗體內(nèi)分離鑒定并命名,并在長(zhǎng)期的劑型研究與蟲(chóng)害防控中,其應(yīng)用技術(shù)逐漸得以成熟發(fā)展,在控制草地蝗蟲(chóng)方面取得了良好的效果[5-9]。

        由于微生物農(nóng)藥在應(yīng)用中可能通過(guò)直接在水體表面施用或土壤徑流、感染微生物的昆蟲(chóng)的遷移等途徑進(jìn)入環(huán)境,不可避免地會(huì)與環(huán)境非靶標(biāo)有益生物暴露接觸。為更好地評(píng)估蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)的環(huán)境暴露風(fēng)險(xiǎn),本研究按照NY/T 3152—2017《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[10-14]要求,選取了5種典型的環(huán)境生物日本鵪鶉、意大利蜜蜂、家蠶、大型溞和斑馬魚(yú)為試驗(yàn)對(duì)象,以探究蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)對(duì)典型環(huán)境生物的毒性效應(yīng)和安全風(fēng)險(xiǎn),為該產(chǎn)品的安全應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

        1 材料和方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        1.1.1 供試生物

        鳥(niǎo)類毒性試驗(yàn):日本鵪鶉(Coturnix japonica),日本鵪鶉種蛋購(gòu)自山東省日照市東港區(qū)老孟孵化場(chǎng),于本單位實(shí)驗(yàn)室孵化后用于試驗(yàn)。

        蜜蜂毒性試驗(yàn):意大利蜜蜂(Apis mellifera),購(gòu)自浙江省義烏市佛堂鎮(zhèn)王煥興蜂廠,在本單位空地上馴養(yǎng)后用于試驗(yàn)。

        家蠶毒性試驗(yàn):家蠶(Bombyx mori),品種為“皓月×菁松”,蠶種由浙江省蠶種質(zhì)量檢驗(yàn)檢疫站提供,催青孵化至二齡起蠶后用于試驗(yàn)。

        溞類毒性試驗(yàn):大型溞(Daphnia magna),其親溞由沈陽(yáng)化工研究院有限公司安全評(píng)價(jià)中心提供,于本單位實(shí)驗(yàn)室繁殖后用于試驗(yàn)。

        魚(yú)類毒性試驗(yàn):斑馬魚(yú)(Brachydanio rerio),AB型品系,種魚(yú)購(gòu)自武漢中科院水生生物研究所的國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心,于本單位實(shí)驗(yàn)室繁殖后用于試驗(yàn)。

        1.1.2 供試微生物農(nóng)藥

        供試微生物農(nóng)藥為0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑,由南通德益化工有限公司生產(chǎn)并提供。

        1.2 試驗(yàn)條件

        各環(huán)境生物毒性試驗(yàn)條件如表1所示。

        表1 不同非靶標(biāo)生物的試驗(yàn)條件

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 鳥(niǎo)類毒性試驗(yàn)

        根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3152.1—2017《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第1部分:鳥(niǎo)類毒性試驗(yàn)》[10],試驗(yàn)按照最大危害暴露量要求設(shè)置1.0×108孢子/kg體重共1個(gè)試驗(yàn)劑量(被試物直接經(jīng)口暴露,即被試物所能配制的最大劑量),同時(shí)設(shè)置滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組。

        試驗(yàn)時(shí),按照每100 g體重日本鵪鶉灌喂0.5 mL試驗(yàn)溶液進(jìn)行,連續(xù)經(jīng)口暴露5 d。每組用日本鵪鶉雌雄各10只,飼養(yǎng)空間不小于300 cm2/鳥(niǎo),2 h中毒癥狀調(diào)查后按常規(guī)方法喂食。處理組、滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行。處理后,每天觀察并記錄受試日本鵪鶉中毒與死亡癥狀,同時(shí)記錄死亡數(shù),死亡數(shù)累計(jì)計(jì)算。

        1.3.2 蜜蜂毒性試驗(yàn)

        根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3152.2—2017《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第2部分:蜜蜂毒性試驗(yàn)》[11]進(jìn)行最大危害暴露量試驗(yàn)(被試物所能配制的最大劑量),同時(shí)設(shè)置滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組。

        蜜蜂接觸毒性試驗(yàn):取0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑10 mL,與100 μL杰效利混勻作為接觸試驗(yàn)的處理溶液(被試物所能配制的最大劑量)。采用“點(diǎn)滴法”進(jìn)行暴露。點(diǎn)滴前,先用CO2麻醉試驗(yàn)蜜蜂,然后用手動(dòng)微量點(diǎn)滴儀對(duì)準(zhǔn)蜜蜂中胸背板處點(diǎn)滴處理藥液或滅活對(duì)照藥液1 μL/蜂,待藥液揮發(fā)后將蜜蜂移入蜂籠中,用脫脂棉浸泡適量50%蔗糖水(W/W),通過(guò)網(wǎng)眼供蜜蜂攝食??瞻讓?duì)照組直接飼喂50%蔗糖水,處理組和對(duì)照組均設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)20只蜜蜂。處理后,每天觀察并記錄供試蜜蜂的中毒癥狀和死亡數(shù)。

        蜜蜂經(jīng)口試驗(yàn):取0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑2.0 g與2.0 g蔗糖混勻,作為經(jīng)口試驗(yàn)的處理溶液(被試物所能配制的最大劑量)。在飼喂器(一次性塑料滴管)中加入400 μL處理藥液或滅活對(duì)照藥液,對(duì)蜜蜂進(jìn)行飼喂。暴露4 h后,測(cè)定每組試驗(yàn)溶液的消耗量,并將飼喂器取出,換用不含被試物的50%蔗糖水進(jìn)行飼喂。處理組和對(duì)照組均設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)20只蜜蜂。處理后,每天觀察并記錄供試蜜蜂的中毒癥狀和死亡數(shù)。

        1.3.3 家蠶毒性試驗(yàn)

        根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3152.3—2017《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第3部分:家蠶毒性試驗(yàn)》[12]進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)按照最大危害暴露量要求設(shè)置0.2億孢子/mL共1個(gè)試驗(yàn)劑量(被試物直接浸漬桑葉,即被試物所能配制的最大劑量),同時(shí)設(shè)置滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組。

        試驗(yàn)時(shí),將2 cm×2 cm左右的桑葉約5.0 g放入保鮮袋中,加入濃度為0.2億孢子/mL的試驗(yàn)藥液5.0 mL,桑葉充分浸潤(rùn)藥液后取出自然晾干后,分成4等份轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中。將二齡起蠶挑入培養(yǎng)皿中,每皿20頭,并蓋上蓋子,于植物培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng),各處理設(shè)4個(gè)重復(fù),每一培養(yǎng)皿為一重復(fù)。試驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行。喂食染毒桑葉24 h后,轉(zhuǎn)入干凈的培養(yǎng)盒內(nèi)每天用不含被試物的桑葉正常飼喂。給藥后,每天觀察并記錄家蠶的中毒癥狀和死亡情況。上簇第8天采繭調(diào)查幼蟲(chóng)死亡數(shù)、死籠數(shù)、結(jié)繭數(shù)、全繭量和繭層量等。計(jì)算家蠶幼蟲(chóng)死亡率、結(jié)繭率、繭層率及化蛹率。

        1.3.4 溞類毒性試驗(yàn)

        根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3152.5—2017《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第5部分:溞類毒性試驗(yàn)》[13]進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)按照最大危害暴露量要求設(shè)計(jì)1.0×106孢子/mL共1個(gè)試驗(yàn)濃度,同時(shí)設(shè)置滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組。

        試驗(yàn)時(shí),將50 mL試驗(yàn)溶液加入到結(jié)晶皿(直徑60 mm)中,然后用滴管加入試驗(yàn)用溞,每皿5只,蓋上結(jié)晶皿蓋后放入光照培養(yǎng)箱。處理組和對(duì)照組均設(shè)4個(gè)平行,每皿為1個(gè)平行。試驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行。試驗(yàn)期間,每天喂新鮮濃縮的羊角月芽藻藻液,每隔3 d更換試驗(yàn)溶液。試驗(yàn)持續(xù)21 d,每天觀察并記錄大型溞受抑制數(shù)和中毒癥狀。

        1.3.5 魚(yú)類毒性試驗(yàn)

        根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3152.4—2017《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第4部分:魚(yú)類毒性試驗(yàn)》[14]進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)按照最大危害暴露量要求設(shè)計(jì)1.0×106孢子/mL共1個(gè)試驗(yàn)濃度,同時(shí)設(shè)置滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組。

        試驗(yàn)時(shí),將斑馬魚(yú)加入到濃度為1.0×106孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)的試驗(yàn)溶液中,每燒杯10尾魚(yú),各處理設(shè)4個(gè)重復(fù),每杯為1重復(fù)。試驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行。試驗(yàn)期間,每天飼喂2次豐年蝦,每隔3 d更換試驗(yàn)溶液。試驗(yàn)持續(xù)30 d,每天觀察并記錄斑馬魚(yú)的飼料食用情況、中毒癥狀和死亡情況。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        應(yīng)用DPS軟件對(duì)試驗(yàn)溶液處理組、滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組進(jìn)行差異顯著性分析,并以此評(píng)估最大危害暴露量下0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑對(duì)不同生物的影響。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 鳥(niǎo)類毒性試驗(yàn)

        試驗(yàn)期間,0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑處理組、滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組的日本鵪鶉均未出現(xiàn)死亡,且各處理日本鵪鶉均表現(xiàn)正常。表明0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑在最大危害暴露量下對(duì)日本鵪鶉無(wú)致死毒性。

        2.2 蜜蜂毒性試驗(yàn)

        蜜蜂接觸試驗(yàn)中空白對(duì)照組和滅活對(duì)照組的蜜蜂平均死亡率分別為1.67%和0,蜜蜂經(jīng)口試驗(yàn)中空白對(duì)照組和滅活對(duì)照組的蜜蜂平均死亡率均為1.67%(表2和表3),符合NY/T 3152.2—2017《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第2部分:蜜蜂毒性試驗(yàn)》中的質(zhì)量控制要求,即空白對(duì)照組受試蜜蜂死亡率不得超過(guò)20%,表明本試驗(yàn)有效。

        蜜蜂接觸試驗(yàn)中,空白對(duì)照組、滅活對(duì)照組和被試物處理組蜜蜂的平均存活率分別為98.3%、100%和100%。在蜜蜂經(jīng)口試驗(yàn)中,空白對(duì)照組、滅活對(duì)照組和被試物處理組蜜蜂的平均存活率分別為98.3%、98.3%和91.7%。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,蜜蜂接觸試驗(yàn)中t=-1,P>0.05。蜜蜂經(jīng)口試驗(yàn)中t=-2.16,P>0.05(表2和表3),表明蜜蜂接觸試驗(yàn)和經(jīng)口試驗(yàn)的被試物處理組與其對(duì)應(yīng)的對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異。因此,0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑在最大危害暴露量下對(duì)蜜蜂無(wú)致死毒性。

        2.3 家蠶毒性試驗(yàn)

        經(jīng)0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑處理后,各處理對(duì)家蠶的影響如下:

        對(duì)家蠶幼蟲(chóng)的影響:處理組、滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組的家蠶幼蟲(chóng)均表現(xiàn)正常,且均未出現(xiàn)死亡,即受試家蠶的死亡率均為0,表明0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑在最大危害暴露量下對(duì)家蠶無(wú)致死毒性。

        表2 0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑對(duì)蜜蜂接觸毒性試驗(yàn)結(jié)果

        表3 0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑對(duì)蜜蜂經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

        對(duì)家蠶化蛹率的影響:空白對(duì)照組、滅活對(duì)照組和處理組的家蠶化蛹率分別為97.5%、96.2%和93.8%。差異顯著性分析表明,處理組家蠶化蛹率與空白對(duì)照組、滅活對(duì)照組之間均無(wú)顯著性差異(表4)。

        對(duì)家蠶產(chǎn)繭量的影響:空白對(duì)照組、滅活對(duì)照組和處理組的家蠶全繭量平均值分別為1.836 9 g、1.846 6 g和1.878 8 g;繭層量平均值分別為0.380 3 g、0.374 3 g和0.379 7 g;繭層率平均值分別為20.85%、20.44%和20.41%。差異顯著性分析表明,處理組家蠶全繭量、繭層量和繭層率與空白對(duì)照組、滅活對(duì)照組之間相比均無(wú)顯著性差異(見(jiàn)表5)。

        表4 0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育、結(jié)繭率及化蛹率的影響

        表5 0.2億孢子/毫升蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑對(duì)家蠶產(chǎn)繭量的影響

        2.4 溞類毒性試驗(yàn)

        試驗(yàn)期間,0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑處理組、滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組的大型溞均未出現(xiàn)中毒癥狀。處理組、滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組的大型溞活動(dòng)抑制率均為0,表明0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑在最大危害暴露量下對(duì)大型溞無(wú)致死毒性。

        2.5 魚(yú)類毒性試驗(yàn)

        試驗(yàn)期間,0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑處理組、滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組斑馬魚(yú)的死亡率均為0,并且斑馬魚(yú)取食正常,無(wú)中毒癥狀,表明0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑在最大危害暴露量下對(duì)斑馬魚(yú)無(wú)致死毒性。

        3 結(jié)論與討論

        本研究選取了5種典型的環(huán)境生物鳥(niǎo)、蜜蜂、家蠶、溞、魚(yú),通過(guò)最大危害劑量試驗(yàn)探究了0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑對(duì)環(huán)境生物的毒性和安全風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn),0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑在最大危害暴露量條件下對(duì)鳥(niǎo)、蜜蜂、家蠶、溞、魚(yú)均無(wú)致死毒性,并且對(duì)家蠶結(jié)繭數(shù)、化蛹率、全繭量、繭層量、繭層率等指標(biāo)均無(wú)顯著性差異影響,表明0.2億孢子/mL蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)懸浮劑對(duì)供試環(huán)境有益生物安全。

        蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)主要通過(guò)感染寄主脂肪細(xì)胞,釋放出孢原質(zhì)裂殖增殖,產(chǎn)生新一代孢子,嚴(yán)重受感染的脂肪體可完全被孢子取代。寄主由于喪失脂肪體,以致取食和活動(dòng)減少,發(fā)育延滯,蛻皮困難,產(chǎn)卵減少,最后死亡。蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)作為疾病可以通過(guò)健蟲(chóng)與病蟲(chóng)的相互殘食、取食孢子污染的食物等自然水平傳播方式,也可通過(guò)母帶直接將該病傳播給子代的垂直傳播方式,在蝗蟲(chóng)種群中傳播、流行[14-15]。故研究蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)對(duì)環(huán)境生物脂肪體的影響,有利于更好地探究蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)對(duì)環(huán)境生物的毒性及其致毒機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),微生物農(nóng)藥在環(huán)境和有機(jī)體內(nèi)存在一個(gè)增值的過(guò)程,除了對(duì)生物體的致死毒性,更多表現(xiàn)在致病性和對(duì)后代的影響。因此,進(jìn)一步深入開(kāi)展蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)等微生物農(nóng)藥在環(huán)境生物親代和子代中的繁殖毒性,比如鳥(niǎo)類繁殖毒性、蜜蜂幼蟲(chóng)毒性、大型溞和魚(yú)類繁殖毒性等有利于更好地評(píng)估微生物農(nóng)藥的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。

        目前,我國(guó)已發(fā)布實(shí)施了微生物農(nóng)藥對(duì)魚(yú)類、鳥(niǎo)類、蜜蜂、家蠶、藻類、溞類等6項(xiàng)毒性試驗(yàn)的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),以及微生物農(nóng)藥環(huán)境增殖試驗(yàn)準(zhǔn)則3項(xiàng)(水、土壤、葉面),尚缺乏微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估程序類的標(biāo)準(zhǔn)[16]。由于微生物農(nóng)藥是活的生物體,通常采用發(fā)酵或培養(yǎng)的技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn),因此給產(chǎn)品質(zhì)量控制帶來(lái)困難,不同批次的產(chǎn)品質(zhì)量差異較大,并且微生物菌種經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)后還存在退化和變異的問(wèn)題。因此,應(yīng)對(duì)微生物農(nóng)藥進(jìn)行深一步的環(huán)境毒理學(xué)研究,關(guān)注長(zhǎng)期生產(chǎn)鏈和應(yīng)用鏈,以及完善后期風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估程序,推進(jìn)微生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

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