張志剛，王 仲，張亞妮，龍 同，萬中義，王開梅，方 偉*，柯少勇*

（1.國家生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，武漢 430064；2.武漢華夏理工學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430223）

蚜蟲是世界性的農(nóng)業(yè)害蟲，它寄主范圍廣、繁殖快、危害嚴(yán)重，常聚集在植株的芽、花蕾、嫩葉或嫩枝上，以尖利的口器刺吸植物汁液。蚜蟲危害輕者引起植物營養(yǎng)惡化、生長緩慢、生長畸形、落葉、萎蔫，嚴(yán)重危害時(shí)導(dǎo)致植物枯死，同時(shí)還傳播多種病毒病。蚜蟲的防治歷來是全世界農(nóng)林業(yè)蟲害防治的重要內(nèi)容[1]，因此開發(fā)高效、低毒、廣譜的新型化學(xué)殺蚜劑，也是當(dāng)務(wù)之急[2-4]。

化學(xué)農(nóng)藥作為害蟲綜合治理過程的重要手段，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起著不可替代的作用。此外，化學(xué)農(nóng)藥還被廣泛用于林業(yè)、水產(chǎn)、畜牧業(yè)、衛(wèi)生害蟲及傳染病的防控等領(lǐng)域。隨著國家環(huán)保力度的加強(qiáng)，在害蟲綜合治理過程中更傾向于采用生物防治方法，但在今后相當(dāng)長的一個(gè)時(shí)期內(nèi)化學(xué)防治仍是害蟲防控的重要手段[5-7]。農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展、環(huán)境保護(hù)、抗性治理和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等均從不同的方面要求不斷加強(qiáng)新農(nóng)藥的創(chuàng)新研究，開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效和環(huán)境友好型“綠色生態(tài)農(nóng)藥”。鑒于此，為了尋求適合用于害蟲綜合治理的綠色生態(tài)型農(nóng)用化學(xué)品，筆者通過化學(xué)生物信息學(xué)等分子合理設(shè)計(jì)方法，獲得了含雙酰胺單元的雜環(huán)亞胺衍生物[8]，部分化合物具有顯著的殺蚜蟲活性。為了進(jìn)一步提高該類化合物的生物利用度，降低其實(shí)際用量，筆者對(duì)高活性化合物HBERC1684進(jìn)行了相應(yīng)的劑型探索，并對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的活性評(píng)價(jià)及比較，確定其較佳的應(yīng)用方法，以期為該類化合物的開發(fā)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

液相色譜分析采用Waters ACQUITY UPLC H-CLASS PDA（Waters）及Waters 2695HPLC分析儀（Waters,Milford,MA,USA）；所用試劑甲醇、醋酸、三氟乙酸、磷酸、鹽酸等均為市售分析純，上海國藥集團(tuán)；化合物HBERC1684的制備參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行；供試害蟲為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)的東方豆蚜，將蚜蟲置于溫度為25℃、相對(duì)濕度為40%～60%的養(yǎng)蟲室飼養(yǎng)，測(cè)試前一天，將蚜蟲轉(zhuǎn)接到1.5 cm高的新豆苗上，每顆豆苗上的接蟲量約30～40頭。

1.2 目標(biāo)化合物鹽的制備

將5 mmol HBERC1684溶于30 mL無水甲醇中，冰水浴條件下緩慢滴加2 當(dāng)量的酸（醋酸、三氟乙酸、磷酸、鹽酸），然后低溫?cái)嚢杓s10～15 min，撤去冰浴，約30 min后，體系析出大量白色固體，繼續(xù)攪拌約2～4 h，減壓抽濾，真空干燥得產(chǎn)物。

1.3 目標(biāo)化合物可溶粉劑制備

將5 g原藥在70～80℃的條件下溶解于約少量的甲醇溶液中，直至完全溶解為黃色透明溶液。將45 g聚乙二醇6000加入蒸發(fā)皿中，在水浴條件下加熱至完全熔化為無色透明液體。將原藥溶解完全的甲醇溶液趁熱加入聚乙二醇液體中，并迅速攪拌均勻。在水浴上繼續(xù)加熱至混合物體積不再改變?yōu)橹?，立即放入冰過的白瓷盤中均勻平鋪，并迅速放入冰箱冷凍保存24 h。取出后放入30℃恒溫烘箱中干燥，研磨，在60目下過篩得到白色粉末狀物質(zhì)。

1.4 可溶粉劑含量測(cè)定

稱取一定量的樣品，用少量甲醇溶解后，定容到10 mL容量瓶。在295 nm波長下測(cè)定吸光度，以相同質(zhì)量的空白制劑作為空白對(duì)照。另取一定量對(duì)照藥品，用甲醇溶解后，定容到10 mL容量瓶，在295 nm波長下測(cè)定吸光度。按式（1）計(jì)算樣品質(zhì)量濃度。

式中：A樣品、A空白、A標(biāo)樣、A甲醇分別為樣品、空白對(duì)照、標(biāo)樣及甲醇的吸光度值；C樣品為樣品的質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.5 可溶粉劑的性能測(cè)試

參考劑型性能測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)所制備的可溶粉劑進(jìn)行了相關(guān)性能的測(cè)試，主要包括細(xì)度、全溶解時(shí)間及熱貯穩(wěn)定性等。

1.5.1 細(xì)度測(cè)定

采用干篩法，詳細(xì)操作步驟按照GB/T 16150—1995《農(nóng)藥粉劑、可濕性粉的細(xì)度測(cè)定方法》進(jìn)行。

1.5.2 全溶解時(shí)間測(cè)定

稱取5.0 g樣品于1 000 mL燒杯中，放置在25±1℃恒溫槽中，加入25℃蒸餾水500 mL（相當(dāng)于稀釋100倍），立即打開秒表，同時(shí)開啟攪拌器，以60～70 r/min的速度攪拌，分別于2 min、3 min、4 min、……吸取上層液10 mL，至分析溶液中有效成分的含量不再增加，所用時(shí)長即為全溶解時(shí)間。

1.5.3 熱貯穩(wěn)定性測(cè)定

參照GB/T 19136—2003《熱貯穩(wěn)定性測(cè)定方法》。將20 g試樣放入燒杯，不加任何壓力，使其鋪成等厚度平滑均勻?qū)?。將圓盤壓在試樣上面，置燒杯于烘箱中，在恒溫箱（54±2℃）中放置14 d。取出燒杯，拿出圓盤，放入干燥器中，使試樣冷卻至室溫。于24 h之內(nèi)檢測(cè)有效成分含量。根據(jù)貯存前含量和貯存后含量求出分解率，有效成分分解率按式（2）計(jì)算。

1.6 活性評(píng)價(jià)

參照NY/T 1154.14—2008《農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺蟲劑第14部分：浸葉法》[9-10]，對(duì)目標(biāo)化合物HBERC1684及其劑型進(jìn)行了殺蟲活性的系統(tǒng)評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HBERC1684鹽的制備及液相色譜分析

為了增加化合物HBERC1684的溶解性，提高其生物利用度，結(jié)合其結(jié)構(gòu)特征，考慮制備其相應(yīng)的鹽。選擇醋酸、三氟乙酸、磷酸、鹽酸等進(jìn)行了成鹽反應(yīng)探索。從圖1可以發(fā)現(xiàn)，在三氟乙酸和鹽酸等強(qiáng)酸的作用下，化合物很快水解，保留時(shí)間分別為1.17、1.18 min；而在醋酸及磷酸條件下，化合物能夠穩(wěn)定存在，保留時(shí)間分別為1.82、1.83 min。

2.2 HBERC1684可溶粉劑的制備及含量測(cè)定

化合物HBERC1684為脂溶性化合物，可溶于甲醇，微溶于乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚等，難溶于水。由于其在水中溶解度差，嚴(yán)重影響其在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用，很容易導(dǎo)致藥效不穩(wěn)定。在化合物的劑型優(yōu)化過程中，采用常規(guī)固體分散劑如環(huán)糊精、聚乙二醇4000及聚乙二醇6000等進(jìn)行了試驗(yàn)探索，但結(jié)果表明環(huán)糊精和聚乙二醇4000 對(duì)化合物HBERC1684的分散效果很差。因此，采用聚乙二醇6000為分散劑，經(jīng)過多次配方和制備過程優(yōu)化，成功研制化合物HBERC1684的可溶粉劑（10%含量），該制劑在質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)，溶液澄清透明，放置長時(shí)間無析出，表明該制劑大大提高化合物在水中溶解度，為進(jìn)一步應(yīng)用研究打下良好基礎(chǔ)。

圖1 化合物HBERC1684 4 種鹽的超高效液相色譜分析

采用紫外分光光度法對(duì)該制劑進(jìn)行了含量的測(cè)定。通過紫外掃描圖譜選取295 nm作為含量測(cè)定波長（圖2）。配制一系列不同濃度的HBERC1684溶液，測(cè)定紫外吸收度，發(fā)現(xiàn)在1～6 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸線方程為y=0.131 3x＋0.069 7，R2=0.999 5，滿足含量測(cè)定要求，結(jié)果見圖3。

圖2 化合物HBERC1684 的紫外光譜分析

圖3 化合物HBERC1684 線性關(guān)系圖

平行稱取3份樣品，用所述方法測(cè)定紫外吸收度并計(jì)算含量，所制備的可溶粉劑的實(shí)際含量為8.96%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%，表明所制備的可濕性粉劑的含量穩(wěn)定，均一性較好。另外制劑回收率為89.6%，可能是在制備過程中樣品殘留導(dǎo)致。

2.3 HBERC1684可溶粉劑的性能測(cè)試

在上述制備的劑型基礎(chǔ)上，對(duì)所制備的可溶粉劑進(jìn)行了細(xì)度、全溶解時(shí)間及熱貯穩(wěn)定性等基本性能測(cè)試。結(jié)果表明，采用干篩法進(jìn)行HBERC1684可溶粉劑的細(xì)度測(cè)定，實(shí)測(cè)值為100%通過80目；全溶解時(shí)間測(cè)試表明所制備的粉劑全溶解時(shí)間為3 min；熱貯穩(wěn)定性測(cè)試表明，所制備的劑型產(chǎn)品在54±2℃溫度下貯存14 d后的分解率為3%～8%，均不超過10%，根據(jù)FAO標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，在54±2℃溫度下貯存14 d后，有效成分的含量下降率小于10%，一般能保證產(chǎn)品生產(chǎn)后兩年期間的熱貯穩(wěn)定性，因此，該制劑符合可溶粉劑熱貯穩(wěn)定性要求。

2.4 殺蟲活性分析

化合物HBERC1684的內(nèi)吸活性較差，且溶解性較差，為了達(dá)到提高化合物內(nèi)吸活性及增加其溶解性的目的，將化合物分別制備成相應(yīng)的磷酸鹽（HBERC1684-H3PO4）及醋酸鹽（HBERC1684-HAc）。母體化合物及其相應(yīng)鹽的殺蟲活性測(cè)試結(jié)果見表1。針對(duì)東方豆蚜的測(cè)試結(jié)果表明，化合物HBERC1684具有顯著的殺蚜蟲活性，與對(duì)照藥物吡蟲啉的活性相當(dāng)；從表1也可知，HBERC1684的磷酸鹽活性與母體化合物HBERC168相當(dāng)，而HBERC1684的醋酸鹽的活性優(yōu)于母體化合物，可能由于磷酸鹽分子量相對(duì)較大，導(dǎo)致其同等摩爾質(zhì)量的化合物量較大，溶解度相對(duì)低于其醋酸鹽，因而活性略低于醋酸鹽。

化合物HBERC1684為脂溶性化合物，由于其在水中溶解度差，嚴(yán)重影響其在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。經(jīng)過多次劑型優(yōu)化，成功研制化合物HBERC1684的可溶粉劑（含量10%）。為了探討該劑型的進(jìn)一步應(yīng)用，我們測(cè)試了其相關(guān)的殺蟲活性，測(cè)試結(jié)果見表2。

從表2可見，10%HBERC1684可溶粉劑呈現(xiàn)出明顯優(yōu)于原藥及對(duì)照藥物吡蟲啉的殺蟲活性，該可溶粉劑在0.312 5 μg/mL的較低濃度下，仍具有較好的殺蟲活性（50%～70%）。在10、5、2.5、1.25、0.625 μg/mL的較高測(cè)試濃度下，豆芽生長狀態(tài)明顯較好，而在較低濃度下，由于蚜蟲的危害導(dǎo)致豆芽生長較矮。

通過上述活性數(shù)據(jù)分析可知，化合物的劑型對(duì)于化合物活性的影響較大，劑型的不斷優(yōu)化改進(jìn)有望提高藥效。

表1 化合物HBERC1684 及其磷酸鹽、醋酸鹽和吡蟲啉的殺蚜蟲活性

表2 化合物HBERC1684（95%原藥）、HBERC1684（10%可溶粉劑）及吡蟲啉的殺蚜蟲活性

3 小結(jié)及討論

本文以具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的化合物HBERC1684為基礎(chǔ)，進(jìn)行了化合物的劑型優(yōu)化及殺蟲活性探討。通過試驗(yàn)研究，成功制備化合物HBERC1684的10%可溶粉劑，活性測(cè)試結(jié)果表明，該劑型能夠明顯提高藥劑的生物活性，從而降低實(shí)際用量，并且其殺蟲活性要明顯優(yōu)于對(duì)照藥劑吡蟲啉，為該化合物的進(jìn)一步應(yīng)用開發(fā)研究打下了良好基礎(chǔ)。

蚜蟲是當(dāng)前最常見的農(nóng)林業(yè)害蟲之一，每年對(duì)多種農(nóng)作物、蔬菜、果樹及園林植物危害嚴(yán)重，針對(duì)此類害蟲的防治仍然離不開化學(xué)防治。而新化合物HBERC1684能夠在較低劑量下殺滅蚜蟲，具有較好的應(yīng)用前景，可作為有效成分應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)害蟲的綜合防控。