劉夢蝶，李志斌，房曉歡，王 卓，聶雨欣，石霖靜，李俊杰，2*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省牛羊胚胎技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000）

體細胞核移植（SCNT）技術(shù)在加快品種改良、縮短家畜繁殖周期等方面有重要應(yīng)用，但克隆效率低下，制約著該技術(shù)的發(fā)展，其中供體細胞不完全重編程是影響SCNT效率的關(guān)鍵因素［1］。DNA甲基化和組蛋白乙?；莾煞N重要的表觀遺傳修飾方式。研究表明，DNA甲基化水平偏高或組蛋白乙酰化水平偏低是SCNT胚胎發(fā)育能力低的重要原因［2-3］。Zebularine是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，添加Zebularine可顯著提高豬［4］、水牛［5］SCNT囊胚發(fā)育率；Scriptaid是組蛋白去乙酰化酶抑制劑，處理豬［6］和牛［7］SCNT重構(gòu)胚，會使胚胎體外發(fā)育能力顯著提高。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院繁殖實驗室曾利用Zebularine和Scriptaid處理綿羊SCNT胚胎，均顯著提高了早期胚胎體外發(fā)育能力［8-10］。SCNT胚胎表觀遺傳修飾異常的根源與供體細胞的分化存在密切聯(lián)系，供體體細胞核移入去核卵母細胞后需經(jīng)過表觀遺傳重編程過程，回到胚胎起始發(fā)育的全能狀態(tài)。為此，Zebularine和Scriptaid處理供體細胞后對SCNT胚胎發(fā)育的影響受到廣泛關(guān)注，Xiong X.等［11］利用Zebularine和Scriptaid處理牛成纖維細胞，增加了牛SCNT胚胎的體外發(fā)育潛力和質(zhì)量。但用Zebularine和Scriptaid等表觀遺傳修飾試劑處理供體細胞后，對細胞增殖、發(fā)育潛能等的影響未見報道，為此，本試驗采用Zebularine和Scriptaid處理綿羊卵丘細胞，研究對細胞增殖、多潛能基因、轉(zhuǎn)化生長因子及甲基轉(zhuǎn)移酶等表達的影響，探討表觀遺傳修飾試劑提高綿羊SCNT胚胎發(fā)育能力的機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 卵母細胞的采集和培養(yǎng)

綿羊卵巢，采集于河北省保定市唐縣某屠宰場。綿羊屠宰后挑選新鮮的卵巢，于3 h內(nèi)送回實驗室，將卵巢上直徑3～6 mm的卵泡切開，在預(yù)熱至37℃的培養(yǎng)液中濾出卵丘、卵母細胞復(fù)合物（COCs），在體式顯微鏡下選擇具有3層及以上卵丘細胞包被且胞漿均勻的COCs用于試驗。將獲得的復(fù)合物放置于成熟培養(yǎng)液中，在38.6℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行體外成熟。

1.2 卵丘細胞的選取和培養(yǎng)

將成熟后的COCs置于透明質(zhì)酸酶中，用槍頭反復(fù)吹打使卵丘和卵母細胞分離，收集卵丘細胞并加入卵丘培養(yǎng)液，在38.6℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，當(dāng)卵丘細胞生長匯合至80%～90%時開始傳代。本試驗使用的是第三代卵丘細胞。

1.3 卵丘細胞的處理與分組

根據(jù)前期試驗結(jié)果，Zebularine（Z4775 Sigma）和Scriptaid（S7817 Sigma）的最佳處理濃度和時間分別為5 nmol／L、12 h［8］和0.2μmol／L、12 h［9］。因此，本試驗設(shè)置3個試驗組，5 nmol／L Zebularine（Z組）和0.2μmol／L Scriptaid單獨處理（S組）及聯(lián)合處理（SZ組）卵丘細胞12 h，及1個不進行藥物處理的對照組。

1.4 MTT法檢測細胞增殖情況

將制成細胞懸液的卵丘細胞按每孔8 000個接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔終體積為200μL。每組設(shè)6個重復(fù)孔，于38.6℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后棄去上清液，每孔加入90μL培養(yǎng)基（康寧）和10μL碧云天（MTT）溶液，38.6℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去培養(yǎng)基，每孔加入110μL Formazan放于水平搖床上低速振蕩10 min（另設(shè)6個調(diào)零孔和6個對照孔）。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處測量各孔吸光度，根據(jù)吸光度計算細胞增殖率。吸光度值越大細胞增殖率越高［12］。

1.5 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及引物條件的確定

RNA提取步驟參照RNA Simple Toal RNA Kit總RNA提取試劑盒（TIANGEN）說明書進行，從各組卵丘細胞中提取總RNA；測定RNA的濃度及純度，符合試驗要求的RNA放于-80℃長期保存，防止降解。提取的綿羊卵丘細胞總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，保存于-20℃，用于后續(xù)試驗。

利用引物合成軟件Primer premier，得到目的基因和內(nèi)參基因的引物序列，序列見表1。

表1 目的基因引物序列

1.6 實時熒光定量PCR

分別以4組卵丘細胞cDNA為模板，以βactin為內(nèi)參進行實時熒光定量PCR檢測，讀取目的基因、內(nèi)參基因的Ct值，用△Ct法（Qr＝2-△△Ct）計算各基因在綿羊卵丘細胞中的相對表達量。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

每組試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果使用SPSS軟件進行單因素方差分析、鄧肯氏多重檢驗，從而得到差異性檢驗結(jié)果。P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT法檢測各處理組細胞的增殖情況

見圖1。

由圖1可知，與對照組相比，Zebularine、Scriptaid聯(lián)合處理及單獨處理后卵丘細胞吸光度差異 不 顯 著（P ＞0.05），證明Zebularine與Scriptaid處理后不會對卵丘細胞增殖產(chǎn)生不良影響。

2.2 熒光定量PCR檢測基因表達情況數(shù)據(jù)分析

采用2-△△Ct方法計算基因相對表達量，結(jié)果見圖2～6。

由圖2～6可知：與對照組相比，單獨使用5 nmol／L Zebularine或0.2μmol／L Scriptaid處理卵丘細胞，多潛能基因Oct4相對表達量顯著增加（P＜0.05）；BMP15和Sox2相對表達量增加但與對照組差異不顯著（P＞0.05）；Zebularine處理后卵丘細胞GDF9基因相對表達量顯著提高（P＜0.05）；單獨及聯(lián)合使用兩種試劑處理后DNMT1相對表達量均顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

自體細胞克隆羊多利降生以來，SCNT技術(shù)取得了重要進展，但供體細胞DNA甲基化水平過高或者組蛋白乙?；竭^低仍然是影響SCNT效率提高的重要問題［4，9］。Zebularine和Scriptaid分別是近年來常用的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和組蛋白去乙酰化酶抑制劑，具有毒性低、效率高的特點。本試驗利用Zebularine、Scriptaid單獨處理和聯(lián)合處理后，對卵丘細胞的增殖率沒有顯著影響，證明兩種藥物處理對卵丘細胞的增殖無不良影響。這與阮秋燕等［13］用Scriptaid處理水牛胎兒成纖維細胞的結(jié)果相一致。

Oct4是多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子，Sox2是一種編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，二者與細胞的發(fā)育潛能存在著密切聯(lián)系。在本試驗中，Zebularine或Scriptaid單獨處理卵丘細胞，多潛能基因Oct4相對表達量與對照組相比差異顯著，聯(lián)合處理對表達無影響。Xiong X.等［11］報道，Zebularine或Zebularine＋Scriptaid聯(lián)合處理牦牛成纖維細胞可使Oct4和Sox2相對表達量增加，進而提高SCNT胚胎發(fā)育能力，本試驗結(jié)果與其相似；盧富春等［14］在豬上也得到了相似的結(jié)果。

BMP15和GDF9是由卵母細胞分泌的兩個生長因子，屬TGFβ超家族成員。BMP15和GDF9能與卵丘細胞上的受體結(jié)合，引起下游基因的級聯(lián)反應(yīng)，影響卵丘細胞的增殖和凋亡，從而調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育與卵母細胞成熟［15］。Du M.等［16］檢測了GDF9在組蛋白去乙?；敢种苿═SA）處理后樣品中的表達水平，結(jié)果TSA對GDF9的表達無顯著影響（P＞0.05）。在卵母細胞來源的因子中，BMP15可促進卵泡生長并被認為具有表觀遺傳效應(yīng)。

DNMT1是重要的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其主要作用是維持甲基化［17］。研究表明，Zebularine可以使DNMT1表達降低或完全缺失［9］，推測其主要是通過抑制DNMT1的表達來降低供體細胞的DNA甲基化水平。在本試驗中，使用 Zebularine和Scriptaid單獨或聯(lián)合處理卵丘細胞，均使DNMT1表達量顯著降低。

值得注意的是，Zebularine和Scriptaid聯(lián)合處理綿羊卵丘細胞后，Oct4、Sox2、BMP15和GDF9表達量雖然均高于對照組，但均低于Zebularine或Scriptaid單獨處理，這可能與這兩種藥物仍具有一定的化學(xué)毒性有關(guān)；或是如果聯(lián)用兩種藥物處理供體體細胞，其最佳劑量和作用時間有待深入研究。 總之，Zebularine和Scriptaid單獨及聯(lián)合處理綿羊卵丘細胞，對細胞增殖無顯著影響，但可提高多潛能基因（Oct4、Sox2）、細胞分化相關(guān)基因（BMP15、GDF9）表達量，降低DNA甲基化相關(guān)基因（DNMT1）表達，表明Zebularine和Scriptaid對綿羊卵丘細胞重編程研究具有重要意義。