張峰偉 楊自華 郭平學(xué) 常盼 于軍 岳樹(shù)強(qiáng)

(1.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西 西安 710038;2西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院科研科，陜西 西安 710038;3.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科，陜西 西安 710038)

膽管癌(Cholangiocarcinoma)來(lái)源于膽管細(xì)胞，發(fā)病隱匿且惡性程度高[1]。患者出現(xiàn)臨床癥狀就醫(yī)時(shí)往往病程至晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)間。膽管癌近年在人群中的發(fā)病呈上升趨勢(shì)，且其具有診斷困難、侵襲強(qiáng)、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差等特點(diǎn)，因此研究促使膽管癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的分子，以便早期控制膽管癌的進(jìn)展成為亟待解決的問(wèn)題。目前諸多臨床研究[2]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞發(fā)生惡性侵襲的基礎(chǔ)是上皮間質(zhì)間轉(zhuǎn)換(epithelial mesenchymal transformation，EMT)，鈣黏蛋白在EMT的發(fā)生時(shí)的表達(dá)變化明顯。N-鈣黏蛋白(N-cadherin)也稱(chēng)作鈣粘著蛋白2(CDH2)，由906個(gè)氨基酸組成、位于人體18q11.2染色體上CDH2基因編碼完成的分子量約140 kd的單戀跨膜糖蛋白[3]。已報(bào)道[4]N-cadherin在多種腫瘤中升高，如卵巢癌、胃癌、黑色素瘤等，如卵巢癌患者病情進(jìn)展過(guò)程中，發(fā)生EMT，N-cadherin的表達(dá)增高，進(jìn)一步促進(jìn)了卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移及病情的發(fā)生發(fā)展。本研究將西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院和第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院近五年的80例膽管癌患者的癌組織及癌旁組織為研究對(duì)象，探討N-cadherin在膽管癌組織中的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年1月至2019年6年在西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院和第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院治療并經(jīng)病理科確診進(jìn)行手術(shù)切除的80例膽管癌組織及相應(yīng)的癌旁組織(≥2 cm)，相應(yīng)組織被切除后立即放入液氮罐中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｋ信R床資料均從原始病例本中獲得。此次臨床試驗(yàn)已經(jīng)通過(guò)西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院和第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查(編號(hào)：L2011015)，患者均簽署知情同意書(shū)。患者中男50例、女30例；年齡37～81歲、平均(59.02±9.39)歲；患者術(shù)前均未接受放化療等治療。嚴(yán)格按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)頒布的第八版惡性腫瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行膽管癌的TNM分期[5]。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 根據(jù)美國(guó)Invitrogen公司的Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取組織中的總RNA：液氮研磨將樣本裂解后，進(jìn)行抽提、漂洗及洗脫操作?？俁NA分離后用Nano Rrop 2000檢測(cè)，日本Takara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲互補(bǔ)DNA。SYBR Green I法進(jìn)行q-PCR分析。檢測(cè)膽管癌組織的N-cadherin mRNA水平，內(nèi)參為GAPDH mRNA的表達(dá)水平。引物列表如下：N-cadherin上游引物5’-TGAAGTCCCCAATGTCTCCA-3’；N-cadherin上游引物5’-GCATCATCATCCTGCTTATCC-3’；GAPDH上游引物5’-AAGGTGAAGGTCGGA GTCAA-3 ’，GAPDH下游引物5’-GGAAGATG GTGATGGGATTT-3’。結(jié)果均重復(fù)3次取平均值后進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1膽管癌組織與癌旁組織的N-cadherin mRNA水平 RT-PCR結(jié)果顯示，膽管癌組織中N-cadherin mRNA(3.42±0.98)的水平高于癌旁組織(2.05±0.64)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.43，P=0.00)。且與癌旁組織相比較，80例中有72例膽管癌組中的N-cadherin mRNA升高，8例膽管癌組織的N-cadherin mRNA降低，見(jiàn)圖1。

圖1 膽管癌組織與癌旁組織中N-cadherin的mRNA比值

2.2膽管癌組織/癌旁組織中N-cadherin的mRNA比值與臨床病理參數(shù)間的聯(lián)系 結(jié)果發(fā)現(xiàn)N-cadherin mRNA在膽管癌組織/癌旁組織的比值與患者的性別、年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)，而與患者的TNM分期、分化的程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及神經(jīng)浸潤(rùn)有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 膽管癌組織/癌旁組織中N-cadherin的mRNA比值與臨床病理參數(shù)間的聯(lián)系

2.3N-cadherin的mRNA對(duì)膽管癌的診斷價(jià)值 結(jié)果發(fā)現(xiàn)膽管癌組織/癌旁組織的N-cadherin mRNA AUC面積為0.88，Cutoff值為2.50，診斷敏感性為83.75%，特異性為77.50%，P=0.00。見(jiàn)圖2。

圖2 N-cadherin的mRNA對(duì)膽管癌的診斷價(jià)值

3 討 論

膽管癌屬于膽道系統(tǒng)高發(fā)、侵襲強(qiáng)、預(yù)后差的惡性腫瘤，近年來(lái)可能由于人們生活習(xí)慣及居住環(huán)境的改變，發(fā)病率逐年遞升[6]。現(xiàn)代生物學(xué)研究表明，腫瘤細(xì)胞向周?chē)M織侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，與細(xì)胞間的粘附功能有關(guān)。EMT的基本條件是細(xì)胞形態(tài)、粘附及遷移力的變化，具體分子表現(xiàn)包括N-cadherin的表達(dá)上調(diào)等?；贓MT在腫瘤發(fā)生中的重要作用，有可能成為治療膽管癌的新靶點(diǎn)。N-cadherin最初在神經(jīng)細(xì)胞及纖維母細(xì)胞上被發(fā)現(xiàn)，N-cadherin的胞內(nèi)片段與存在于細(xì)胞骨架上的連環(huán)蛋白相互作用，胞外同相鄰細(xì)胞上的同種分子相互連接，不僅向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號(hào)，還參與細(xì)胞間的粘附功能。目前發(fā)現(xiàn)N-cadherin的表達(dá)異常增高促進(jìn)前列腺癌血管生成、增強(qiáng)黑色素瘤、卵巢癌、食管癌等細(xì)胞的侵襲能力[7]。有研究[8]報(bào)道上調(diào)黑色素瘤細(xì)胞中N-cadherin的表達(dá)時(shí)，癌細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)；敲除黑色素瘤細(xì)胞中的N-cadherin基因時(shí)，癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯，停留在G1期。另有研究[9]分析骨肉瘤患者血液中N-cadherin時(shí)發(fā)現(xiàn)，N-cadherin表達(dá)水平高的患者預(yù)后明顯差于N-cadherin表達(dá)水平低的人。其分子機(jī)制可能是：過(guò)表達(dá)的N-cadherin蛋白激活MAPKERK信號(hào)通、誘導(dǎo)MMPS基因的表達(dá)、加速腫瘤的血管形成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲；此外，過(guò)表達(dá)N-cadherin與PDGFR、FGFR等分子相互作用激活PI3K、MAPK等信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分裂增殖，加速腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，N-cadherin在膽管癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁組織，高、中分化組織的表達(dá)明顯比低分化組織低(P<0.05)，提示N-cadherin與生物學(xué)行為有關(guān)，且分化越差，表達(dá)越高。此外，此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)N-cadherin的異常表達(dá)與患者的年齡、性別無(wú)明顯聯(lián)系，但與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤(rùn)有關(guān)，且晚期N-cadherin的表達(dá)明顯高于早期，提示N-cadherin與膽管癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。ROC結(jié)果顯示：N-cadherin AUC面積為0.88，診斷敏感性為83.75%，特異性為77.50%，這些回顧性的研究提示N-cadherin 對(duì)膽管癌具有診斷價(jià)值，可能可以成為膽管癌治療的新靶標(biāo)基因，在臨床前及臨床科研的研究中發(fā)揮前瞻性的作用。

綜上所述，N-cadherin mRNA在膽管癌組織的表達(dá)升高，且生物學(xué)行為越差、分期越晚，其表達(dá)量越高。