賈智若，陳明偉，李文秀，陳美安，甄漢深

（廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200）

佛手散，又名芎湯，出自《普濟本事方》卷十，由當歸、川芎藥對等比例配伍組方，是養(yǎng)血活血、行氣散瘀的中醫(yī)經(jīng)典方劑，近年臨床上多用于腦中風、腦動脈硬化癥、深靜脈血栓等心腦血管疾病的治療，療效確切［1-5］。

本課題組前期對佛手散水煎劑的化學成分進行了分析，研究發(fā)現(xiàn)佛手散水煎劑成分較為復雜，主要由有機酚酸類和苯酞類成分組成。其中酚酸類代表成分阿魏酸具有抑制血小板聚集、抗血栓、抗氧化等作用，而苯酞類代表成分洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯被證實是對心腦血管起保護作用的主要成分，這4種有效成分的藥效與佛手散的藥理作用相吻合［5-7］。目前關(guān)于佛手散水煎劑有效成分含量測定已有一些報道，多見于對其中單個有效成分的含量測定［8-10］，多種活性成分同時測定的方法鮮有報道，也未見采用超高效液相色譜法（UPLC）測定的報道。本試驗建立UPLC法同時測定佛手散水煎劑中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯的含量測定方法，以期為該方湯劑的質(zhì)量控制提供方法和依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器 Agilent 1290超高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；FD-5N冷凍干燥機（日本Eyela株式會社）；BP211D電子分析天平（德國Sartorius公司）；LG16-W型離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；HKD-100超純水機（深圳Pnike公司）。

1.2 試藥與試劑 當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels（批號20130401）、川芎Ligusticum chunxiong Hort.（批號20130215）飲片購自廣東紫云軒藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥用植物教研室梁子寧教授鑒定符合藥典要求；阿魏酸對照品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110773-201313）；藁本內(nèi)酯對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111737-201305）；洋川芎內(nèi)酯A（深圳伽馬科技有限公司，含量為98%，批號：20130301）；洋川芎內(nèi)酯Ⅰ（深圳伽馬科技有限公司，含量為98%，批號：20130405）；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC液相色譜條件 Eclipse plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相A相為甲醇，B相為0.2%醋酸水溶液，進行梯度洗脫：0～5 min，A相保持5%；5～20 min，A 相從5%線性改變至20%；20～40 min，A相從20%線性改變至40%；40～65 min，A相從40%改變至80%；流速：0.2 ml/min；檢測波長：280 nm；進樣量：5 μl；柱溫：30℃。對照品及供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1 UPLC色譜圖

2.2 佛手散水煎劑的制備 按處方比例（1∶1）精密稱取當歸、川芎粗粉各30g，加10倍量水浸泡30min，煎煮3次，每次60 min，濾過，合并3次濾液，減壓濃縮后得生藥含量為0.2g/ml的佛手散水煎劑，經(jīng)冷凍干燥制成粉末，備用。

2.3 混合對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯對照品各適量，分別置于棕色量瓶中，加甲醇配制成含阿魏酸1.88 mg/ml、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ0.92 mg/ml、洋川芎內(nèi)酯A 1.22 mg/ml、藁本內(nèi)酯0.68 mg/ml的對照品貯備溶液。

2.4 供試品溶液的制備 精密稱取佛手散凍干粉0.501 1 g，置于5 ml棕色量瓶中，加去離子水溶解，定容至刻度，搖勻，靜置，取上清液，用0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 線性關(guān)系的考察 精密吸取2.3項下各對照品貯備液適量，置于同一10 ml棕色量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，配制成阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯濃度依次為382.9μg/ml、371.1μg/ml、97.21 μg/ml、27.62 μg/ml的混合對照品溶液，并逐級稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列對照品溶液，按照2.1項下色譜條件進樣5 μl測定。以峰面積（Y）為縱坐標，濃度X（μg/ml）為橫坐標，繪制標準曲線，計算各自的回歸方程和線性范圍，結(jié)果見表1。4個化合物在各自線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，靈敏度較高。

表1 標準曲線回歸方程及線性范圍

2.6 精密度試驗 取同一批佛手散水煎劑樣品，于1 d內(nèi)連續(xù)重復進樣6次，連續(xù)3 d分別進樣分析，記錄阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的峰面積值，計算4種成分的日內(nèi)精密度（n=6）和日間精密度（n=3），結(jié)果顯示阿魏酸的日內(nèi)精密度RSD為0.79%，日間精密度RSD為1.08%；洋川芎內(nèi)酯Ⅰ的日內(nèi)精密度RSD為1.01%，日間精密度RSD為1.49%；洋川芎內(nèi)酯A的日內(nèi)精密度RSD為0.94%，日間精密度RSD為1.35%；藁本內(nèi)酯的日內(nèi)精密度RSD為1.15%，日間精密度RSD為2.05%。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份佛手散供試品溶液，按2.1項下色譜條件，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進樣5 μl，分別測定各指標成分的峰面積。在12 h內(nèi)阿魏酸的平均含量為0.971 1 mg/g，RSD為0.92%（n=6）；洋川芎內(nèi)酯Ⅰ的平均含量為0.737 9 mg/g，RSD為1.56%（n=6）；洋川芎內(nèi)酯A的平均含量為0.226 0 mg/g，RSD為1.93%（n=6）；藁本內(nèi)酯的平均含量為0.067 9 mg/g，RSD為1.71%（n=6），表明樣品至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗 取同一批佛手散樣品，按2.4項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣5 μl測定。阿魏酸的平均含量為1.033 5 mg/g，RSD為0.46%（n=6）；洋川芎內(nèi)酯Ⅰ的平均含量為0.816 6 mg/g，RSD為1.81%（n=6）；洋川芎內(nèi)酯A的平均含量為0.287 8 mg/g，RSD為1.55%（n=6）；藁本內(nèi)酯的平均含量為0.071 6 mg/g，RSD為1.78%（n=6）。

2.9 加樣回收率試驗 取同一批已知含量的佛手散樣品粉末（過三號篩）6份，每份約0.25 g，精密稱定，置半微量圓底燒瓶中，分別準確加入低、中、高3個濃度各2份的對照品貯備液適量，加水2.5 ml回流煎煮3次，每次60 min，濾過，濾渣洗滌2次，合并濾液，濃縮定容至5 ml，搖勻，靜置，取上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。按2.1項下色譜條件分別進樣5μl測定分析，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果 （n=6）

2.10 樣品測定 分別稱取3批佛手散凍干粉樣品，按2.4供試品溶液制備項下方法制備，吸取5 μl供試品溶液進樣分析，按外標一點法計算佛手散煎劑中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A以及藁本內(nèi)酯的含量，結(jié)果見表3。

表3 佛手散煎劑中4種藥效成分含量測定結(jié)果（n=3）

3 討 論

本研究為使各成分獲得最大靈敏度和分離度，同時又簡化操作，先采用DAD檢測器對阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)脂A、藁本內(nèi)脂此4種藥效成分進行全波長掃描，再根據(jù)各成分最大吸收波長與含量的多少，最終確定各成分檢測波長為280 nm。鑒于佛手散水煎劑成分復雜，采用常規(guī)的等度洗脫條件難以實現(xiàn)對此4種成分的有效分離，為此，實驗過程中又分別選取不同的流動相系統(tǒng)及梯度洗脫條件對樣品進行試驗，結(jié)果以甲醇-0.2%醋酸水溶液為流動相進行梯度洗脫基線平穩(wěn)，各色譜峰分離度佳。

中藥復方成分復雜，僅以其中單一成分為指標的質(zhì)量控制方法顯然有失偏頗，由單一成分定量向多指標、多成分定量是中藥質(zhì)量評價的發(fā)展方向。目前佛手散水煎劑以及單味藥當歸和川芎水煎劑的含量測定均有報道，多以單個阿魏酸或川芎嗪為指標進行含量測定［8-10］。本試驗建立了UPLC法在同一色譜條件下同時測定佛手散水煎劑中4種藥效成分的方法，不同批次樣品含量測定結(jié)果表明，建立的方法具有良好的重現(xiàn)性與適用性，可較全面地評價佛手散水煎劑的質(zhì)量，可為佛手散水煎劑及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。