韋 斌，莫雪梅，王 強(qiáng)，姜 浩，葉星江，林洪升，盧健棋

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2.武警廣西總隊(duì)醫(yī)院，廣西 南寧 530003；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201；4.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

心功能不全是由于各種原因?qū)е滦呐K泵血功能下降，排血量絕對或相對不足，使血液在脈管運(yùn)行不暢所致的一種病理狀態(tài)。早期心功能不全屬于無明顯癥狀的心力衰竭，此時(shí)心臟發(fā)揮代償功能，如不進(jìn)行治療，將發(fā)展為有癥狀的慢性心力衰竭。心肌梗死（簡稱“心梗”）后心功能不全（簡稱“心衰”）是臨床上心功能不全發(fā)生的常見類型［1］。雖然心梗診療手段的進(jìn)步提高了患者的生存率，但是心梗后心衰常導(dǎo)致預(yù)后不良，心衰的發(fā)病率、死亡率高，是多種器質(zhì)性心臟病患者幾乎不可避免的結(jié)局。中醫(yī)認(rèn)為心衰的病因病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)之證。中藥冠通方在臨床上治療心力衰竭有良好療效［2］，本研究觀察中藥冠通方對心梗后心衰大鼠心肌細(xì)胞過氧化物酶體增殖物活化受體γ輔助激活因子-1α（PGC-1α）和腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）蛋白的影響，探討中藥治療心衰的機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SD雌性大鼠，體質(zhì)量250～320 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2017-0023；動(dòng)物飼料由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥品及主要試劑 冠通方顆粒（由人參、三七、丹參、黃芪、地龍、全瓜蔞、絞股藍(lán)、陳皮等組成），由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院制劑室提供，規(guī)格為每包3.5 g（每克相當(dāng)于含生藥4 g）；卡托普利片（中美上海施貴寶制藥有限公司產(chǎn)品，國藥準(zhǔn)字H31022816，規(guī)格：每片25 mg）；PGC-1α（ABCAM公司）；AMPK抗體（ABCAM公司）；二抗（ABCAM公司）；Western blot凝膠試劑盒（碧云天公司）。

1.3 儀器 DW-3000型小動(dòng)物呼吸機(jī)（北京智鼠多寶生物科技有限公司）；DYY-7C型電泳儀（北京六一廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 心梗后心衰大鼠動(dòng)物模型的制作 參考文獻(xiàn)［3］的造模方法：大鼠予10%的水合氯醛（4 ml/kg）麻醉，麻醉后固定，監(jiān)測大鼠心電圖，無創(chuàng)氣管并插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行正壓通氣，潮氣量約7 ml，呼吸頻率70次/分鐘；呼吸比為2∶1。在胸骨左緣捫及心臟搏動(dòng)處縱行切開皮膚約2 cm，逐層鈍性分離皮下組織、肌肉，剪斷第三、四肋間開胸，充分暴露心臟。用生理鹽水潤濕棉球保護(hù)肺臟組織，小心剝離心包膜，在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間，以左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，盡可能找到冠狀動(dòng)脈前降支，于左心耳根部下方5 mm處以2/0縫合針線穿過并結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支（LAD），以心電圖ST段弓背向上抬高大于0.1 mV并持續(xù)5 min以上作為結(jié)扎成功的標(biāo)志，最后清除胸腔積血并縫合關(guān)閉胸腔。假手術(shù)組只穿針線不結(jié)扎。

2.2 分組與給藥 手術(shù)前隨機(jī)抽取6只大鼠作為假手術(shù)組，其余18只大鼠按2.1項(xiàng)方法進(jìn)行造模。手術(shù)3 d后，將心梗后心衰模型大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：模型對照組、冠通方組、卡托普利組。大鼠分組后分籠飼養(yǎng)，每天早上9點(diǎn)定時(shí)灌胃，藥物用量根據(jù)人-大鼠臨床用藥劑量換算公式［4］換算成大鼠用藥量。假手術(shù)組和模型對照組予生理鹽水灌胃；冠通方組灌服給予冠通方溶液，劑量為2.5 g/（kg·d）；卡托普利組灌服給予卡托普利溶液，劑量為0.002 5 g/（kg·d）。各組連續(xù)給藥4周，于末次給藥2 h后進(jìn)行取材。

2.3 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測 取左室心肌100 mg，提取蛋白后采用Western blot半定量測定。應(yīng)用非連續(xù)梯度SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離（AMPK的分子量約為62 kD，分離膠的濃度為8%；PGC-1α的分子量約為91 kD，分離膠的濃度為8% ；濃縮膠的濃度均為6%）。轉(zhuǎn)入PVDF膜上，先用5%的脫脂奶室溫封閉2 h，再分別用抗AMPK或PGC-1α的一抗于4℃孵育過夜。將膜洗滌2遍后，分別用1∶5 000標(biāo)記有過氧化物酶的羊抗兔或兔抗羊的二抗，37℃孵育2 h。充分洗滌后，加入ECL超敏發(fā)光試劑發(fā)光，壓片時(shí)間1 min，測定各條帶的灰度值。記錄時(shí)，各蛋白的表達(dá)水平以相應(yīng)區(qū)帶的灰度值相對于內(nèi)參β-actin灰度的比值代表其相對含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件做數(shù)據(jù)處理分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間兩兩比較，用單因素方差分析，以P＜0.05為有顯著性差異。

3 結(jié) 果

3.1 動(dòng)物一般情況 心梗后心衰模型大鼠精神萎靡，毛發(fā)蓬松，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，能進(jìn)食進(jìn)水，尿量增多，毛色蠟黃、臟亂粗糙。給予青霉素治療1周后，大鼠一般狀態(tài)良好，精神恢復(fù)，反應(yīng)靈敏，活動(dòng)自如，能梳理毛發(fā)，毛發(fā)顏色逐漸被梳理整潔。

3.2 心肌細(xì)胞觀察

3.2.1 心肌細(xì)胞肉眼觀察情況 解剖大鼠可見，造模大鼠的心臟可見殘留的線頭和纖維化的壞死區(qū)，心尖部鈍圓略呈球形，橫切面可見心腔擴(kuò)大，未壞死區(qū)心肌飽滿，心室壁肌層稍厚，壞死區(qū)域呈灰白色纖維化膜，失去肌肉組織，從外觀上看，心肌細(xì)胞可能發(fā)生心肌重塑。假手術(shù)組心臟大小正常，未見畸形變化。

3.2.2 心肌細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu) 見圖1。假手術(shù)組心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，大小相同，肌纖維排列緊密且有序規(guī)則。模型對照組部分區(qū)域心肌大小不一，排列不規(guī)則，心肌細(xì)胞梗死區(qū)由纖維瘢痕組織代替，壞死區(qū)心室壁變薄，壞死區(qū)邊緣心肌排列松散，不規(guī)則，心肌細(xì)胞增大，表明大鼠心梗造模成功。冠通方組、卡托普利組均可見心肌細(xì)胞代償性增大，排列整齊，心肌纖維橫紋較粗大。

圖1 各組心肌細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)HE染色圖 （×200）

3.3 各組PGC-1α、AMPK蛋白表達(dá)量比較 見圖2、圖3和表1。

圖2 各組PGC-1α表達(dá)條帶

圖3 各組AMPK蛋白表達(dá)條帶

表1 各組大鼠心肌組織中PGC-1α、AMPK蛋白表達(dá)量比較 （±s）

表1 各組大鼠心肌組織中PGC-1α、AMPK蛋白表達(dá)量比較 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型對照組比較，②P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型對照組冠通方組卡托普利組n 6 6 6 6劑量（g/kg）— —2.5 0.002 5 PGC-1α 0.604±0.018 0.392±0.014①0.535±0.035②0.495±0.053②AMPK蛋白0.876±0.030 0.760±0.047①0.858±0.035②0.810±0.012②

表1結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型對照組的PGC-1α、AMPK蛋白均顯著降低（P＜0.05），表明大鼠心梗造模成功；與模型對照組比較，冠通方組和卡托普利組的PGC-1α、AMPK蛋白均顯著升高（P＜0.05），提示冠通方和卡托普利可促進(jìn)心梗后心衰心肌細(xì)胞的PGC-1α和AMPK蛋白表達(dá)，從而達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

4 討論

過氧化物酶體增殖物活化受體γ輔助激活因子-1α（PGC-1α）是一種功能強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)輔助激活因子，能夠調(diào)節(jié)線粒體ATP的合成，刺激線粒體生物合成，促進(jìn)肝糖原的異生以及脂肪酸β氧化等一系列能量代謝。因此，PGC-1α是心肌細(xì)胞能量代謝的一個(gè)重要蛋白分子［5-7］。腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）是一種在真核細(xì)胞生物中廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［8］。AMPK激活后，通過影響線粒體生成、蛋白質(zhì)合成及分解在細(xì)胞的生長和分化過程中發(fā)揮重要作用［9-10］。研究表明，通過AMPK等途徑介導(dǎo)活化PGC-1α，能激活下游的核呼吸因子、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A，增強(qiáng)心肌線粒體的功能，促進(jìn)ATP的生成，給心肌細(xì)胞提供能量［11-12］。通過促進(jìn)AMPK等途徑而激活PGC-1α，可能是冠通方治療心力衰竭的靶點(diǎn)。

慢性心衰屬祖國醫(yī)學(xué)“喘證”“水腫”等范疇，屬本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之證［13-15］，慢性心衰的中醫(yī)病理機(jī)制是心氣虛乏、運(yùn)血無力，冠通方正是基于冠心病“正氣虛于內(nèi)，痰瘀血痹于中”之病機(jī)認(rèn)識，采用益氣養(yǎng)陰、清熱解毒化痰、行氣活血、化瘀通絡(luò)的原則立法遣方，具有益氣養(yǎng)陰、清熱解毒化痰、行氣活血、化瘀通絡(luò)之功，諸藥合用切中病機(jī)。現(xiàn)代研究表明，冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死，壞死區(qū)周圍的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，心功能不全逐漸惡化。冠通方是方顯明教授在長期的醫(yī)療實(shí)踐中總結(jié)出來的復(fù)方制劑［16］。已有的研究表明，絞股藍(lán)對缺血心肌具有保護(hù)作用［17］；丹參具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗氧化、保護(hù)心肌細(xì)胞等作用［18］；人參治療慢性心功能衰竭具有強(qiáng)心、減輕心臟前后負(fù)荷、減少心肌對氧的需求量、改善心臟內(nèi)微循環(huán)等作用［19-20］；黃芪可通過抑制磷酸二酯酶和鈣調(diào)蛋白的活性，減少cAMP的分解，增加鈣內(nèi)流和肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣釋放，加強(qiáng)心肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)，產(chǎn)生強(qiáng)心作用，其作用強(qiáng)度與劑量呈正相關(guān)［21-22］。許多試驗(yàn)亦證明黃芪具有明顯的正性肌力作用，其作用類似非洋地黃類正性肌力藥物。

本研究建立心梗后誘發(fā)心衰的實(shí)驗(yàn)大鼠模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PGC-1α和AMPK蛋白在模型對照組中表達(dá)明顯降低，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），用冠通方和卡托普利片干預(yù)后，大鼠心肌細(xì)胞PGC-1α和AMPK蛋白表達(dá)明顯升高，與模型對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示冠通方可促進(jìn)心梗后心衰心肌細(xì)胞的PGC-1α和AMPK蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到保護(hù)心梗后心肌細(xì)胞的作用。