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        中藥冠通方對(duì)心梗后心功能不全大鼠心肌細(xì)胞PGC-1α和AMPK蛋白的影響

        2020-07-07 04:59:20莫雪梅葉星江林洪升盧健棋
        廣西中醫(yī)藥 2020年3期
        關(guān)鍵詞:卡托普利心梗心肌細(xì)胞

        韋 斌,莫雪梅,王 強(qiáng),姜 浩,葉星江,林洪升,盧健棋

        (1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院,廣西 南寧 530011;2.武警廣西總隊(duì)醫(yī)院,廣西 南寧 530003;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院,廣西 南寧 530201;4.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023)

        心功能不全是由于各種原因?qū)е滦呐K泵血功能下降,排血量絕對(duì)或相對(duì)不足,使血液在脈管運(yùn)行不暢所致的一種病理狀態(tài)。早期心功能不全屬于無明顯癥狀的心力衰竭,此時(shí)心臟發(fā)揮代償功能,如不進(jìn)行治療,將發(fā)展為有癥狀的慢性心力衰竭。心肌梗死(簡(jiǎn)稱“心?!保┖笮墓δ懿蝗ê?jiǎn)稱“心衰”)是臨床上心功能不全發(fā)生的常見類型[1]。雖然心梗診療手段的進(jìn)步提高了患者的生存率,但是心梗后心衰常導(dǎo)致預(yù)后不良,心衰的發(fā)病率、死亡率高,是多種器質(zhì)性心臟病患者幾乎不可避免的結(jié)局。中醫(yī)認(rèn)為心衰的病因病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)之證。中藥冠通方在臨床上治療心力衰竭有良好療效[2],本研究觀察中藥冠通方對(duì)心梗后心衰大鼠心肌細(xì)胞過氧化物酶體增殖物活化受體γ輔助激活因子-1α(PGC-1α)和腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)蛋白的影響,探討中藥治療心衰的機(jī)理。

        1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1 動(dòng)物 SD雌性大鼠,體質(zhì)量250~320 g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(桂)2017-0023;動(dòng)物飼料由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

        1.2 藥品及主要試劑 冠通方顆粒(由人參、三七、丹參、黃芪、地龍、全瓜蔞、絞股藍(lán)、陳皮等組成),由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院制劑室提供,規(guī)格為每包3.5 g(每克相當(dāng)于含生藥4 g);卡托普利片(中美上海施貴寶制藥有限公司產(chǎn)品,國(guó)藥準(zhǔn)字H31022816,規(guī)格:每片25 mg);PGC-1α(ABCAM公司);AMPK抗體(ABCAM公司);二抗(ABCAM公司);Western blot凝膠試劑盒(碧云天公司)。

        1.3 儀器 DW-3000型小動(dòng)物呼吸機(jī)(北京智鼠多寶生物科技有限公司);DYY-7C型電泳儀(北京六一廠)。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 心梗后心衰大鼠動(dòng)物模型的制作 參考文獻(xiàn)[3]的造模方法:大鼠予10%的水合氯醛(4 ml/kg)麻醉,麻醉后固定,監(jiān)測(cè)大鼠心電圖,無創(chuàng)氣管并插管,連接小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行正壓通氣,潮氣量約7 ml,呼吸頻率70次/分鐘;呼吸比為2∶1。在胸骨左緣捫及心臟搏動(dòng)處縱行切開皮膚約2 cm,逐層鈍性分離皮下組織、肌肉,剪斷第三、四肋間開胸,充分暴露心臟。用生理鹽水潤(rùn)濕棉球保護(hù)肺臟組織,小心剝離心包膜,在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間,以左冠狀靜脈主干為標(biāo)志,盡可能找到冠狀動(dòng)脈前降支,于左心耳根部下方5 mm處以2/0縫合針線穿過并結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD),以心電圖ST段弓背向上抬高大于0.1 mV并持續(xù)5 min以上作為結(jié)扎成功的標(biāo)志,最后清除胸腔積血并縫合關(guān)閉胸腔。假手術(shù)組只穿針線不結(jié)扎。

        2.2 分組與給藥 手術(shù)前隨機(jī)抽取6只大鼠作為假手術(shù)組,其余18只大鼠按2.1項(xiàng)方法進(jìn)行造模。手術(shù)3 d后,將心梗后心衰模型大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組:模型對(duì)照組、冠通方組、卡托普利組。大鼠分組后分籠飼養(yǎng),每天早上9點(diǎn)定時(shí)灌胃,藥物用量根據(jù)人-大鼠臨床用藥劑量換算公式[4]換算成大鼠用藥量。假手術(shù)組和模型對(duì)照組予生理鹽水灌胃;冠通方組灌服給予冠通方溶液,劑量為2.5 g/(kg·d);卡托普利組灌服給予卡托普利溶液,劑量為0.002 5 g/(kg·d)。各組連續(xù)給藥4周,于末次給藥2 h后進(jìn)行取材。

        2.3 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) 取左室心肌100 mg,提取蛋白后采用Western blot半定量測(cè)定。應(yīng)用非連續(xù)梯度SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離(AMPK的分子量約為62 kD,分離膠的濃度為8%;PGC-1α的分子量約為91 kD,分離膠的濃度為8% ;濃縮膠的濃度均為6%)。轉(zhuǎn)入PVDF膜上,先用5%的脫脂奶室溫封閉2 h,再分別用抗AMPK或PGC-1α的一抗于4℃孵育過夜。將膜洗滌2遍后,分別用1∶5 000標(biāo)記有過氧化物酶的羊抗兔或兔抗羊的二抗,37℃孵育2 h。充分洗滌后,加入ECL超敏發(fā)光試劑發(fā)光,壓片時(shí)間1 min,測(cè)定各條帶的灰度值。記錄時(shí),各蛋白的表達(dá)水平以相應(yīng)區(qū)帶的灰度值相對(duì)于內(nèi)參β-actin灰度的比值代表其相對(duì)含量。

        2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件做數(shù)據(jù)處理分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間兩兩比較,用單因素方差分析,以P<0.05為有顯著性差異。

        3 結(jié) 果

        3.1 動(dòng)物一般情況 心梗后心衰模型大鼠精神萎靡,毛發(fā)蓬松,反應(yīng)遲鈍,活動(dòng)減少,能進(jìn)食進(jìn)水,尿量增多,毛色蠟黃、臟亂粗糙。給予青霉素治療1周后,大鼠一般狀態(tài)良好,精神恢復(fù),反應(yīng)靈敏,活動(dòng)自如,能梳理毛發(fā),毛發(fā)顏色逐漸被梳理整潔。

        3.2 心肌細(xì)胞觀察

        3.2.1 心肌細(xì)胞肉眼觀察情況 解剖大鼠可見,造模大鼠的心臟可見殘留的線頭和纖維化的壞死區(qū),心尖部鈍圓略呈球形,橫切面可見心腔擴(kuò)大,未壞死區(qū)心肌飽滿,心室壁肌層稍厚,壞死區(qū)域呈灰白色纖維化膜,失去肌肉組織,從外觀上看,心肌細(xì)胞可能發(fā)生心肌重塑。假手術(shù)組心臟大小正常,未見畸形變化。

        3.2.2 心肌細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu) 見圖1。假手術(shù)組心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,大小相同,肌纖維排列緊密且有序規(guī)則。模型對(duì)照組部分區(qū)域心肌大小不一,排列不規(guī)則,心肌細(xì)胞梗死區(qū)由纖維瘢痕組織代替,壞死區(qū)心室壁變薄,壞死區(qū)邊緣心肌排列松散,不規(guī)則,心肌細(xì)胞增大,表明大鼠心梗造模成功。冠通方組、卡托普利組均可見心肌細(xì)胞代償性增大,排列整齊,心肌纖維橫紋較粗大。

        圖1 各組心肌細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)HE染色圖 (×200)

        3.3 各組PGC-1α、AMPK蛋白表達(dá)量比較 見圖2、圖3和表1。

        圖2 各組PGC-1α表達(dá)條帶

        圖3 各組AMPK蛋白表達(dá)條帶

        表1 各組大鼠心肌組織中PGC-1α、AMPK蛋白表達(dá)量比較 (±s)

        表1 各組大鼠心肌組織中PGC-1α、AMPK蛋白表達(dá)量比較 (±s)

        注:與假手術(shù)組比較,①P<0.05;與模型對(duì)照組比較,②P<0.05

        組 別假手術(shù)組模型對(duì)照組冠通方組卡托普利組n 6 6 6 6劑量(g/kg)— —2.5 0.002 5 PGC-1α 0.604±0.018 0.392±0.014①0.535±0.035②0.495±0.053②AMPK蛋白0.876±0.030 0.760±0.047①0.858±0.035②0.810±0.012②

        表1結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型對(duì)照組的PGC-1α、AMPK蛋白均顯著降低(P<0.05),表明大鼠心梗造模成功;與模型對(duì)照組比較,冠通方組和卡托普利組的PGC-1α、AMPK蛋白均顯著升高(P<0.05),提示冠通方和卡托普利可促進(jìn)心梗后心衰心肌細(xì)胞的PGC-1α和AMPK蛋白表達(dá),從而達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

        4 討論

        過氧化物酶體增殖物活化受體γ輔助激活因子-1α(PGC-1α)是一種功能強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)輔助激活因子,能夠調(diào)節(jié)線粒體ATP的合成,刺激線粒體生物合成,促進(jìn)肝糖原的異生以及脂肪酸β氧化等一系列能量代謝。因此,PGC-1α是心肌細(xì)胞能量代謝的一個(gè)重要蛋白分子[5-7]。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)是一種在真核細(xì)胞生物中廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[8]。AMPK激活后,通過影響線粒體生成、蛋白質(zhì)合成及分解在細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過程中發(fā)揮重要作用[9-10]。研究表明,通過AMPK等途徑介導(dǎo)活化PGC-1α,能激活下游的核呼吸因子、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A,增強(qiáng)心肌線粒體的功能,促進(jìn)ATP的生成,給心肌細(xì)胞提供能量[11-12]。通過促進(jìn)AMPK等途徑而激活PGC-1α,可能是冠通方治療心力衰竭的靶點(diǎn)。

        慢性心衰屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)“喘證”“水腫”等范疇,屬本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之證[13-15],慢性心衰的中醫(yī)病理機(jī)制是心氣虛乏、運(yùn)血無力,冠通方正是基于冠心病“正氣虛于內(nèi),痰瘀血痹于中”之病機(jī)認(rèn)識(shí),采用益氣養(yǎng)陰、清熱解毒化痰、行氣活血、化瘀通絡(luò)的原則立法遣方,具有益氣養(yǎng)陰、清熱解毒化痰、行氣活血、化瘀通絡(luò)之功,諸藥合用切中病機(jī)?,F(xiàn)代研究表明,冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死,壞死區(qū)周圍的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡,心功能不全逐漸惡化。冠通方是方顯明教授在長(zhǎng)期的醫(yī)療實(shí)踐中總結(jié)出來的復(fù)方制劑[16]。已有的研究表明,絞股藍(lán)對(duì)缺血心肌具有保護(hù)作用[17];丹參具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗氧化、保護(hù)心肌細(xì)胞等作用[18];人參治療慢性心功能衰竭具有強(qiáng)心、減輕心臟前后負(fù)荷、減少心肌對(duì)氧的需求量、改善心臟內(nèi)微循環(huán)等作用[19-20];黃芪可通過抑制磷酸二酯酶和鈣調(diào)蛋白的活性,減少cAMP的分解,增加鈣內(nèi)流和肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣釋放,加強(qiáng)心肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián),產(chǎn)生強(qiáng)心作用,其作用強(qiáng)度與劑量呈正相關(guān)[21-22]。許多試驗(yàn)亦證明黃芪具有明顯的正性肌力作用,其作用類似非洋地黃類正性肌力藥物。

        本研究建立心梗后誘發(fā)心衰的實(shí)驗(yàn)大鼠模型,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PGC-1α和AMPK蛋白在模型對(duì)照組中表達(dá)明顯降低,與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),用冠通方和卡托普利片干預(yù)后,大鼠心肌細(xì)胞PGC-1α和AMPK蛋白表達(dá)明顯升高,與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示冠通方可促進(jìn)心梗后心衰心肌細(xì)胞的PGC-1α和AMPK蛋白的表達(dá),從而達(dá)到保護(hù)心梗后心肌細(xì)胞的作用。

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