舒錦，汪海婭，金立

1.上海市靜安區(qū)市北醫(yī)院老年科，上海200443；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院老年科，上海200001

隨著社會老齡化的發(fā)展，心血管疾病嚴(yán)重威脅老年人的健康和生命。心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是以心臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞過度增殖、膠原過度沉積及異常分布為特征的心臟間質(zhì)重構(gòu)，是各種心血管疾病發(fā)展到一定階段的共同病理表現(xiàn)，最終導(dǎo)致心臟功能衰竭而死亡[1]。目前對MF 的發(fā)病機(jī)制并不十分明確。血管緊張素II（AngII）是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的中心信號分子，對心肌細(xì)胞的成纖維化過程具有十分重要作用[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶3（）是細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)劑，參與疾病的發(fā)生、組織修復(fù)和重塑。研究發(fā)現(xiàn)，在AngII 誘導(dǎo)的大鼠心臟成纖維細(xì)胞中顯著上調(diào)，并且其在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中具有較高的節(jié)度點(diǎn)，是心臟重構(gòu)的關(guān)鍵基因[3]。本研究通過構(gòu)建過表達(dá)和敲低的細(xì)胞，探討對心肌纖維化細(xì)胞活力的影響，為預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化探索新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠心肌細(xì)胞H9C2 購自于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。AngII 和左卡尼汀采購自上海源葉生物科技有限公司?？蛰d體、過表達(dá)質(zhì)粒、si-RNA-negative control (siRNA-NC)、siRNA-（1/2/3）由研載生物技術(shù)（上海）有限公司提供。Lipofectamin 300 采購自Thermo Fisher Scientific 公司。RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT Master Mix）和RNAiso Plus購自于TaKaRa 公司。CCK8 檢測試劑盒購自于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠心肌細(xì)胞H9C2 用新鮮配制的含10%胎牛血清和1%雙抗的DEME 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞的貼壁情況。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至80%～90%時，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)好的H9C2 細(xì)胞用無雙抗的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按每孔5×105個細(xì)胞，將細(xì)胞接種至6 孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過夜。次日，更換細(xì)胞培養(yǎng)液為無血清培養(yǎng)液，每孔1 500L。根據(jù)制造商的說明，利用Lipofectamin 3000 制備不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)染液。即：a，4LLipofectamin 3000+250L 無血清Opti-MEM 培養(yǎng)基，室溫靜置5 min；b，3g 空載體/過表達(dá)質(zhì)粒或100 nM siRNA-NC/siRNA-(1/2/3) +250L 無血清Opti-MEM 培養(yǎng)基，室溫靜置5 min；將上述a、b 混合，室溫靜置20 min，制備成不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)染液空白對照組只添加Lipofectamin 3000 和無血清培養(yǎng)基。將上述制備完成的不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染液轉(zhuǎn)接于6 孔板中，6 h 后，更換培養(yǎng)液，加入完全培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h 后，收集細(xì)胞，用RNA 提取試劑盒提取不同組別細(xì)胞的總RNA，熒光定量PCR 檢測的表達(dá)水平，用于評估細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 AngII 處理 細(xì)胞最佳條件的篩選按每孔5×105個細(xì)胞，將H9C2 細(xì)胞接種至12 孔板中，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過夜。分別用0、10-8、10-7、10-6M 的AngII 分別處理H9C2 細(xì)胞6 h，12 h 和24 h。處理后，收集不同時間點(diǎn)的細(xì)胞，提取其細(xì)胞總RNA，用于后續(xù)的分析。

1.2.4 熒光定量PCR （RT-qPCR）參照Liu 等[4]的方法進(jìn)行RT-qPCR 分析。根據(jù)RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，對提取的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。然后進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增，其引物序列如表1所示。RTqPCR 的反應(yīng)條件為50℃3 min，95℃3 min，95℃10 s，60℃30 s，40 個循環(huán)。其中，GAPDH 作為內(nèi)參，和Axl 的mRNA 表達(dá)水平采用2-△△Ct 方法計(jì)算[5]。

表1 引物序列

1.2.5 CCK-8 檢測細(xì)胞活力 心肌細(xì)胞的活力用CCK-8檢測試劑盒進(jìn)行檢測。按每孔5×105個細(xì)胞，將H9C2細(xì)胞接種至6 孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜。將細(xì)胞分成H9C2 組、心肌細(xì)胞纖維化組（MF 組）、MF+si-NC組、MF+si-組和MF+組。其中，MF 組、MF+si-NC 組、MF+si-組和MF+組的細(xì)胞均先用10-8M 濃度的AngII 處理24 h 后，分別用不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)染液轉(zhuǎn)染H9C2 細(xì)胞。H9C2 組用等劑量的PBS 以相同方式進(jìn)行處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后，對5 組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將上述5 組細(xì)胞按每孔1×104個細(xì)胞接種于96 孔板中，混勻后，細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜。第2 天用100M 左卡尼汀處理MF 組和MF+組的細(xì)胞，其余組的細(xì)胞用等劑量的PBS 處理。培養(yǎng)24、48、72 和96 h 時后，每孔加入10L CCK-8 溶液。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2.5 h 后（OD 值≤2.0），用酶標(biāo)儀在波長450 nm 處檢測其吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 作圖和統(tǒng)計(jì)分析軟件均為Graphpad prism 5。計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較進(jìn)行單因素方差（one-way ANOVA）分析。以＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率 采用RT-qPCR 檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的mRNA 表達(dá)水平。見圖1。與siRNA-NC 組相比，的表達(dá)水平在siRNA-(1) 組和siRNA-(2) 組中均降低（＜0.01），但其在siRNA-(1) 中，其下降幅度更大（圖1A）。因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，采用siRNA-(1) 進(jìn)行轉(zhuǎn)染H9C2 細(xì)胞，構(gòu)建敲低的細(xì)胞。圖1B 表明，與空載質(zhì)粒組相比，的mRNA 表達(dá)水平在過表達(dá)組中增加（＜0.01），其值約是空載質(zhì)粒組的80 000 倍。說明過表達(dá)細(xì)胞成功構(gòu)建，可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 AngII 最佳濃度的選擇 圖2顯示，用不同濃度的AngII 處理細(xì)胞6 h 后，Axl 的表達(dá)水平與未用AngII處理的相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；而處理12 h后，Axl 的表達(dá)水平僅在濃度為10-8M 組中下降（＜0.05）。當(dāng)處理24 h 后，與未處理的相比，Axl 的表達(dá)水平在用不同濃度AngII 處理的組別中均下調(diào)（＜0.01），并且濃度為10-8M 的效果更顯著。因此，本研究最終選用濃度為10-8M 的AngII 處理細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9C2 纖維化。

圖1 在干擾和過表達(dá)中的mRNA 表達(dá)水平：與空白對照相比，**＜0.01；與siRNA-NC 組相比，#＜0.01

圖2 不同濃度的AngII 處理H9C2 細(xì)胞6 h、12 h 和24 h 后，Axl 基因的mRNA 表達(dá)水平。與未用AngII 處理的相比，*＜0.05、**＜0.01

圖3 不同方式處理H9C2 細(xì)胞24 h（A）、48 h（B）、72 h（C）和96 h（D）后的細(xì)胞活力。與H9C2 組相比，＜0.05；與MF 組相比，＜0.05；與MF+100 M 左卡尼汀組相比，＜0.05

3 討論

MF在心臟和血管重塑的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，與高血壓、心肌梗死、動脈粥樣硬化、糖尿病等臨床許多疾病和病理過程有著密切的聯(lián)系[6-8]。MF 可致心力衰竭、心律失常和心源性猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥，預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化有助于為治療老年心血管疾病提供新的分子靶點(diǎn)。

AngII 是一種血管活性肽，對心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞有直接促進(jìn)生長的作用，從而導(dǎo)致心血管重構(gòu)，所以常作為一種促纖維化因子被用于誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的成纖維化[9]。Axl 屬于受體酪氨酸激酶，其在脈管系統(tǒng)、心肌、血管內(nèi)皮等正常組織以及多種腫瘤組織中均有表達(dá)，與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，Axl 的表達(dá)水平與心肌纖維化過程密切相關(guān)[10]。因此，本研究采用不同濃度的AngII處理大鼠心肌細(xì)胞不同時間，通過測量Axl 的表達(dá)情況來選擇最佳的處理濃度與時間。結(jié)果表明，10-8M的AngII 處理H9C2 心肌細(xì)胞24 h，可以誘導(dǎo)細(xì)胞纖維化。

當(dāng)心肌成纖維化細(xì)胞被激活增殖時，細(xì)胞外基質(zhì)的合成分泌會增強(qiáng)，從而進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞纖維化[11]。因此，通過抑制心肌成纖維化細(xì)胞的活性和增殖，可以抑制心肌成纖維化的過度積累，延緩心肌重構(gòu)的發(fā)展。左卡尼汀是一種心肌能量代謝藥物，可對心肌代謝予以調(diào)節(jié)，并有研究證實(shí)左卡尼汀可以有效的治療心肌炎[12]。不僅能夠降解膠原，而且還能降解基底膜成分，是其他幾種（-1，-7，-8，-9）的激活劑[13]。本研究通過檢測心肌成纖維化細(xì)胞的細(xì)胞活性，來探究對心肌成纖維化過程的影響。結(jié)果表明，當(dāng)成纖維化細(xì)胞中敲低時，細(xì)胞活性受到抑制，與用100M 左卡尼汀處理后的細(xì)胞活性相似；而當(dāng)成纖維化細(xì)胞中過表達(dá)時，其細(xì)胞活性增強(qiáng)；說明敲低可以抑制心肌成纖維化細(xì)胞的活性，抑制其纖維化過程。有證據(jù)顯示，在動脈粥樣硬化中，表達(dá)的增加更容易增加斑塊破裂的可能性，從而促進(jìn)心肌梗死和中風(fēng)的發(fā)生[14]。Münch 等[15]分析了54 例肥厚型心肌患者的纖維化生物標(biāo)記物，研究結(jié)果顯示，的表達(dá)水平與心臟疾?。〞炟?，心室性心博過速等）呈正相關(guān)關(guān)系。此外，另外一項(xiàng)研究表明，與假手術(shù)組相比，在結(jié)扎小鼠冠狀動脈左前降支（一種心衰模型）的動物模型中，的表達(dá)水平上調(diào)，心肌纖維化增加；表明的上調(diào)與心肌纖維化的增加密切相關(guān)[16]。結(jié)合本研究結(jié)果，可以推測過表達(dá)會促進(jìn)心肌纖維化過程，而敲低可能會通過降低心肌纖維化細(xì)胞的活力，來抑制成纖維化細(xì)胞的增殖，從而延緩老年患者心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生。