高 尚，蔣國芳*，范冰冰

(1. 泉州師范學(xué)院海洋與食品學(xué)院，福建泉州 362000；2. 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210023)

漸滲是指一個種的遺傳物質(zhì)通過雜交與反復(fù)回交穿越種間障礙轉(zhuǎn)入到另一個物種內(nèi)的現(xiàn)象，又稱漸滲雜交(Introgressive hybridization) (Anderson，1953)。自然界中10%的動物和25%的植物都存在著雜交現(xiàn)象(Mallet, 2005)，而雜交常常會導(dǎo)致基因漸滲(Bowley & Taylor, 1987)。國外對于蝗蟲基因漸滲的研究已有一些報道。Arnold等(1987)使用限制性酶切技術(shù)最早發(fā)現(xiàn)澳洲1種蝗蟲Calediacaptiva的2個亞種在1個狹窄的雜交區(qū)發(fā)生了rDNA漸滲。之后，歐洲小翅雛蝗Chorthippusparallelus2個鄰接亞種在比利牛斯雜交區(qū)的核DNA漸滲(Vazquezetal., 1994)及其比利牛斯山東部雜交區(qū)的基因漸滲(Shukeretal., 2005)，澳洲Morabine蝗蟲(Kawakamietal., 2011)和亞洲稻蝗Oxyahylaintricate(Lietal., 2011)的基因漸滲，瑞士1種小車蝗Oedaleusdecorus的線粒體基因的歷史性漸滲(Kindleretal., 2012)以及新西蘭蝗蟲1個瀕危屬Sigaus2個種間的基因漸滲(Dowleetal., 2014)均有較為深入的研究，至2015年P(guān)edraza-Lara等人對墨西哥具有重要經(jīng)濟價值的Sphenarium屬蝗蟲線粒體基因漸滲的情況進行了檢測。在這些報道中，Kindler等(2012)和Dowle等(2014)分別使用了11個和3個微衛(wèi)星位點標記數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果顯示對漸滲現(xiàn)象有較好的分辨率。

竹蝗是我國竹林的重要害蟲，其中著名的有黃脊竹蝗Ceracriskiangsu和青脊竹蝗C.nigricornis(圖1)(陳永林，2007)。黃脊竹蝗和青脊竹蝗在我國主要分布于云南、廣西、海南、廣東、福建、浙江、安徽、河南、重慶、貴州、四川、陜西、甘肅和臺灣等14個省，同時前者在江蘇省尚有分布(鄭哲民和夏凱齡，1998)。多方面證據(jù)已表明，黃脊竹蝗與青脊竹蝗并非姊妹種(易傳輝，2003；許升全等，2005；和秋菊等，2011；Gaoetal., 2018)。不過，有意思的是，本課題組多年來野外采集發(fā)現(xiàn)，這兩種竹蝗在我國南方的大片竹林中常常是同時存在，呈現(xiàn)出同域分布狀態(tài)。

本文采用微衛(wèi)星遺傳標記法檢測安徽金寨縣青脊竹蝗和黃脊竹蝗之間是否發(fā)生基因漸滲事件，明確這兩種竹蝗基因的流動方向，為今后竹蝗屬物種形成和遺傳分化的研究提供有效科學(xué)依據(jù)。

圖1 青脊竹蝗(a)和黃脊竹蝗(b)Fig.1 Ceracris nigricornis (a) and Ceracris kiangsu (b)

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用的標本是2014年采集于安徽省金寨縣張沖鄉(xiāng)(E 116.0195, N 31.4335)(圖2)的青脊竹蝗和黃脊竹蝗各16頭個體(雌雄各8頭)，共32頭個體。所有標本采集后，送回實驗室鑒定物種完畢后，使用液氮快速冷凍處理，并保存于-80℃冰箱中直到提取總DNA。

圖2 竹蝗采樣地點Fig.2 Sampling location for bamboo locusts

1.2 總DNA提取、引物選擇、PCR產(chǎn)物擴增和分型

利用本課題組改良的酚-氯仿法提取研究樣品的總DNA (Xuanetal., 2009)，并將DNA稀釋為30～50 ng/μL的終濃度用于后續(xù)的PCR反應(yīng)。從上述32頭標本的后足股節(jié)肌肉中提取總DNA。本實驗從Xuan等(2009)報道的12對引物中篩選出5對引物，引物詳細信息參見表1。微衛(wèi)星引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，熒光基團(TAMRA，F(xiàn)AM，HEX)在PCR加樣操作過程中添加。

表1 本研究中使用的微衛(wèi)星引物

微衛(wèi)星序列的PCR反應(yīng)在BIO-RAD S1000 PCR儀上進行，總反應(yīng)體系為15 μL，包括包括2.5 μL 10 × PCR buffer，2 μL dNTP mixture (2.5 mM)，0.2 μL Taq polymerase (5 U/μL)，1 μL正反引物(5 μM/L)，1 μL DNA模板，加水至15 μL。擴增反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，退火30 s(不同的引物退火溫度不同，根據(jù)引物適當調(diào)整)，72℃延伸30 s，共32個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

PCR擴增產(chǎn)物首先用瓊脂糖凝膠電泳檢測是否有目標產(chǎn)物(100～400 bp)，符合目標大小的產(chǎn)物可在ABI 3500 XL遺傳自動分析儀上進行基因分型，片段大小參照GS 600 Tamara熒光分子量標準(ABI Inc.，USA)。等位基因分型結(jié)果使用GeneMarker V2.2.0(Soft Genetics LLC, USA)軟件讀取。每個結(jié)果均讀取2次以上以防止人工誤差，并以雙欄模式(Two column format)將擴增產(chǎn)物片段長度作為等位基因輸入Excel電子表格。使用Excel Microsatellite Tool kit程序(Park, 2001)和Convert version 1.31(Glaubitz, 2004)對結(jié)果進行整理和統(tǒng)計分析，轉(zhuǎn)化為其他各種遺傳學(xué)分析軟件所需要的格式。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用CERVUS 2.0(Marshall, 2001)和POPGENE version 1.32(Yehetal., 1999)軟件計算以下遺傳多樣性參數(shù)：平均等位基因數(shù)目(Na)，有效等位基因數(shù)目(Ne)，觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)，多態(tài)信息含量(PIC)(Botsteinetal., 1980)。

用GENEPOP version 3.4(Raymond and Rousset, 2004)通過馬爾科夫鏈方法(Markov chain method)無偏P值估計，設(shè)置1000 dememorization number，500 batches，and 1000 iterations per batch，計算哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE)偏離測試以及位點間的連鎖不平衡檢驗(Linkage Disequilibrium，LD)。用Bonferroni correction進行微衛(wèi)星位點偏離HWE顯著性水平的檢驗(Rice, 1989)。

對于遺傳結(jié)構(gòu)分析，本研究使用STRUCTURE 2.3.4軟件(Pritchardetal., 2000)，基于貝葉斯方法(Bayesian)，使用混合祖先模型(Admixture model)和相關(guān)等位基因頻率模型(Allele frequencies correlated model)對青脊竹蝗和黃脊竹蝗同域分布的地理種群32個體進行遺傳聚類數(shù)K的估算，將所有個體分別納入相對應(yīng)的分組之中，并計算各推斷聚類的成員系數(shù)比例(proportion of membership coefficient)。設(shè)定聚類數(shù)K=1～10，100萬次MCMC重復(fù)運算，丟棄前10萬次不穩(wěn)定的結(jié)果，分別運行10次求平均值。根據(jù)Evanno等(2005)所提出的方法，通過計算連續(xù)K值之間Ln P (D)變化率的大小(ΔK)來做折線圖選擇最佳K值，即得群體遺傳結(jié)構(gòu)的分組數(shù)(Evannoetal., 2005)。在所有個體的分配中，依據(jù)成員最高比例(highest percentage of membership)將所有個體分配到相應(yīng)的分組。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

本文采用5對微衛(wèi)星引物對安徽金寨縣的黃脊竹蝗和青脊竹蝗種群共32個樣品進行了分析，共檢測到60個等位基因，每個位點擁有等位基因10～13個，平均為12個，其中WJ625位點檢測到等位基因數(shù)最少；各位點的期望雜合度(He)范圍為0.711～0.885，平均預(yù)期雜合度為0.833；觀測雜合度(Ho)均為1。每個位點都具有較高的多態(tài)性(WJ625最低為0.661)，平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.799，說明這些位點都存在著豐富的遺傳信息。在哈迪-溫伯格平衡檢測中，2個種群在所有位點上均顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(以下簡稱為哈溫平衡)(P<0.01)(表2)。在整體水平上，所有微衛(wèi)星位點對之間為顯著的連鎖不平衡(LD)。

2.2 哈迪溫伯格平衡檢測

在本研究使用的5個微衛(wèi)星位點，用Bonferroni校正后，根據(jù)第一種假設(shè)(H1)：雜合子缺乏，黃脊竹蝗3個位點(WJ623,WJ625和WJ630)顯示出顯著偏離哈溫平衡(表3)。

表2 本研究中微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性

注：**，P<0.01。

表3 哈迪溫伯格平衡檢測(H1=Heterozygote deficiency)

Table 3 Results of Hardy-Weinberg Equilibrium test

A.黃脊竹蝗種群Ceracriskiangsupopulation

LocusP-valSEW&CR&HWJ6220.18360.02610.00510.0525WJ6230.01150.00130.46110.3778WJ6250.00000.00000.29290.2090WJ6260.24120.03970.07140.0166WJ6300.00000.00000.65750.5213

B.青脊竹蝗種群Ceracrisnigricornispopulation

LocusP-valSEW&CR&HWJ6221.0000-0.0690-0.0690-0.0356WJ6231.00000.0000-0.1060-0.0462WJ6250.99330.0051-0.2245-0.0325WJ6260.99800.0016-0.2162-0.0413WJ6301.00000.0000-0.3793-0.0815

注：P-val，檢驗的P值；SE，標準誤；W&C，Weir & Cockerham’s (1984)估計；R&H，Robertson & Hill’s (1984)估計。下表同。Note:P-val，Pvalue of the test；SE，standard error；W&C，Weir & Cockerham’s (1984) estimate；R&H，Robertson & Hill’s (1984) estimate.Same below.

根據(jù)第二種假設(shè)(H2)：雜合子過量，青脊竹蝗部分位點(WJ630)顯示出顯著偏離哈溫平衡(表4)。

通過比較上述P值，本研究發(fā)現(xiàn)黃脊竹蝗種群有3個微衛(wèi)星位點顯著偏僻哈溫平衡，其中WJ625和WJ630極顯著(表3)，而青脊竹蝗種群也有3個位點顯著偏離哈溫平衡，但只有1個位點(WJ630)極顯著，說明2種竹蝗的群體結(jié)構(gòu)均不穩(wěn)定，且黃脊竹蝗更甚。

表4 哈迪溫伯格平衡檢測(H2=Heterozygote excess)

Table 4 Results of Hardy-Weinberg Equilibrium test

A.黃脊竹蝗種群Ceracriskiangsupopulation

LocusP-valSEW&CR&HWJ6220.88300.0151 0.00510.0525WJ623 0.98910.00070.46110.3778WJ6251.00000.00000.29290.2090WJ6260.73810.02980.07140.0166WJ6301.00000.00000.65750.5213

B.青脊竹蝗種群Ceracrisnigricornispopulation

LocusP-valSEW&CR&HWJ6220.34200.0538-0.0690-0.0356WJ6230.22360.0386-0.1060-0.0462WJ6250.02650.0187-0.2245-0.0325WJ6260.02340.0138-0.2162-0.0413WJ6300.00000.0000-0.3793-0.0815

2. 3 遺傳結(jié)構(gòu)與關(guān)系

當K=2時，L (K)和ΔK值均為最大值，表明K=2為最佳分組(圖3)。

STRUCTURE的聚類分析表明(圖4)，當K=2時，黃脊竹蝗種群個體聚為一組(紅色)，青脊竹蝗種群聚為另一組。青脊竹蝗種群的部分樣品包含黃脊竹蝗的遺傳物質(zhì)，而黃脊竹蝗種群的遺傳背景比較一致。

圖3 基于△K 最大時的最合適K值Fig.3 Optimum K value when△K is the largest

圖4 基于貝葉斯分析的黃脊竹蝗種群和青脊竹蝗種群聚類結(jié)果(K=2)Fig.4 Bayesian inference of the number of clusters (K=2) for the Ceracris kiangsu and Ceracris nigricornis populations analyzed by STRUCTURE注：編碼1-16為1號種群黃脊竹蝗個體，編碼17-32為2號種群青脊竹蝗個體。Note: Codes 1-16 are individuals of Ceracris kiangsu and codes 17-32 are Ceracris nigricornis.

3 討論與結(jié)論

在群體遺傳學(xué)研究中，物種變異程度和群體適應(yīng)性隨著觀測雜合度增大而增大。從本研究結(jié)果來看，黃脊竹蝗和青脊竹蝗的物種變異程度和群體適應(yīng)性均很大。不過，各微衛(wèi)星位點的觀測雜合度均為1，處于最大值，可能與觀測雜合度受樣本量大小的變化而出現(xiàn)明顯變異有很大的關(guān)系(李鷗等，2009；楊君等，2018)，因此該結(jié)果的參考價值并不大。而期望雜合度(He)則是判斷遺傳多樣性的重要指標，它用于辨別群體中雜合度比率偏離的情況。本研究中各位點的期望雜合度(He)均大于0.70，表明這些種群屬于高度多態(tài)，遺傳多樣性水平較高。

在假設(shè)雜合子缺乏情形下，黃脊竹蝗種群部分位點顯著地偏離哈迪溫伯格平衡。這可能是由于黃脊竹蝗的種群結(jié)構(gòu)更加不穩(wěn)定，更容易受到突變、選擇、雜交和遺傳漂變等因素的影響，及受近交和無效等位基因等因素的影響。造成偏離哈溫平衡的原因有很多，一方面可能是存在無效等位基因(Pembertonetal., 1995)，而被誤認為純合子，因而導(dǎo)致偏離哈溫平衡；另一方面也可能是由于本研究的樣本數(shù)量不足夠大(李鷗等，2009；牛東紅等，2010)。同時，本研究在局域水平展示了維持或者強化遺傳結(jié)構(gòu)的多態(tài)性證據(jù)。本研究檢測到了同域分布物種間的基因流。貝葉斯聚類分析結(jié)果顯示，基因流是從黃脊竹蝗種群到青脊竹蝗種群的。也可能是因為黃脊竹蝗種群多分布于竹林郁閉度較高的區(qū)域，青脊竹蝗多分布于郁閉度較低的竹林外緣區(qū)域，而黃脊竹蝗雄性要比雌性更加具有擴散能力(Baileyetal., 2007；Ortegoetal., 2011)，所以黃脊竹蝗雄性個體由竹林深處向外緣擴散，從而可能與青脊竹蝗雌性個體發(fā)生交配。

最后，本研究聚焦于地理種群水平上的遺傳差異基因漸滲事件，檢測了種群內(nèi)的差異。這顯示同域分布的黃脊竹蝗和青脊竹蝗種群間發(fā)生了基因漸滲，但本研究目前不能確定其是不是來自遺傳漂變和瓶頸期的信號。竹蝗屬于植食性昆蟲，影響其種群分化的原因有很多，如遷移能力和地理隔離，寄主植物的選擇以及生境片段化等。一般情況下，基因流受到地理距離阻礙，導(dǎo)致遺傳分化。一些遷飛能力較強的物種分布區(qū)較廣如東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis，增加了基因交流，從而削弱了種群間分化，一般有比較弱的地理格局。此外，頻繁、強烈的基因流能夠影響遺傳變異的均質(zhì)化、選擇、突變以及遺傳漂變等(Slatkin, 1987)。然而，青脊竹蝗和黃脊竹蝗種群間遺傳和種群動力的相互作用仍需要繼續(xù)深入探索。對于竹蝗這樣的非模式生物物種，目前尚無其全基因組數(shù)據(jù)可利用。不過，新近開發(fā)的簡化基因組技術(shù)(reduced representation genome sequencing，RRGS)(魏書軍等，2016)可以通過對某物種大量個體的基因組進行測序而滿足此目的，并具有較高的可靠度，可用于進一步研究同域分布物種間的基因漸滲現(xiàn)象。

致謝：南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究生李冉同學(xué)跟隨本文通訊作者前往安徽金寨縣采集竹蝗標本，泉州師范學(xué)院李明杰同學(xué)協(xié)助繪制插圖，特此致謝！