張春渝，許小瓊，張梓浩，陳裕坤，林玉玲，賴鐘雄

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州350002）

長期以來，在人類的固有思維里都認(rèn)為蛋白質(zhì)需要折疊成一定的三維結(jié)構(gòu)，才能發(fā)揮生物學(xué)功能。直到20世紀(jì)90 年代，這種固有思維被逐漸打破，人們發(fā)現(xiàn)有一類蛋白在天然孤立狀態(tài)下，沒有一個明確唯一的三維結(jié)構(gòu)，局部或完全不折疊，但是也能發(fā)揮一定的生物學(xué)功能[1-2]。研究者們將這類蛋白稱之為固有無序蛋白質(zhì)（intrinsically disordered protein，IDPs）或天然無折疊蛋白質(zhì)（nativelyun folded protein，NUP）[3]。在發(fā)現(xiàn)的初期，人們曾將這類蛋白稱為垃圾蛋白質(zhì)組（junk proteome）[4]，認(rèn)為它不具有什么功能。但伴隨著人們對蛋白質(zhì)研究的深入，這類蛋白的生物學(xué)功能逐漸被挖掘，如多肽類激素（polypeptide hormones），是植物體內(nèi)一類重要的信號物質(zhì)，在植物的防御、受精以及生長和發(fā)育方面起著重要作用，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)其在溶液狀態(tài)下是無序的[5-6]。值得注意的是，無序蛋白中存在著特殊的作用機(jī)制，當(dāng)無序蛋白和其他蛋白質(zhì)相結(jié)合時，能夠折疊成有序結(jié)構(gòu)，因而存在一系列快速互變的構(gòu)象[2]。目前，預(yù)測蛋白是否具有無序區(qū)已然成為當(dāng)下的一個熱點。據(jù)悉，在著名的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測的比賽Critical Assessment of Structure Prediction 中[7]，預(yù)測無序蛋白已經(jīng)成為一項比賽的內(nèi)容，可見固有無序蛋白在蛋白質(zhì)研究中的重要性。

無患子科龍眼屬龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是熱帶和亞熱帶的常綠果樹之一，具有豐富的營養(yǎng)與藥用價值。HD-Zip 作為植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子，在植物的應(yīng)激脅迫中發(fā)揮著重要作用[8-9]。同樣，有研究結(jié)果表明，固有無序蛋白因為自身結(jié)構(gòu)的特點，可在植物受到逆境脅迫時快速反應(yīng)，從而減少逆境對植物的傷害[1]。如脫水蛋白（DHNs）可穩(wěn)定細(xì)胞膜從而減少擬南芥受到冷凍脅迫時的傷害[10]；擬南芥的ANAC019 介導(dǎo)的ABA 超敏反應(yīng)與其無序C-端的TRD（transcription regulatory domain）有關(guān)[11]。故固有無序蛋白在植物應(yīng)答以及適應(yīng)逆境方面發(fā)揮著重要作用[12]。目前對于龍眼HD-Zip 無序蛋白的研究尚屬空白，因此有必要對龍眼HD-Zip 固有無序蛋白進(jìn)行預(yù)測，進(jìn)一步探究龍眼HD-Zip 參與植物應(yīng)激脅迫的分子機(jī)制。

該文通過對實驗室基因組數(shù)據(jù)庫中提取出來的19 條龍眼HD-Zip 的蛋白序列進(jìn)行無序蛋白區(qū)域的預(yù)測、無序區(qū)域的特征以及無序區(qū)域與有序區(qū)域氨基酸序列偏好性的分析，以期為進(jìn)一步研究龍眼HD-Zip 的結(jié)構(gòu)與功能、蛋白互作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所實驗室構(gòu)建的龍眼基因組數(shù)據(jù)庫（NCBI 登錄號：BioProject PRJNA305337）中提取的19 條HD-Zip 成員的蛋白序列。

1.2 方法

于 DISOPRED3[13]（http：//bioinf. cs. ucl. ac.uk/psipred/disopred=1）在線網(wǎng)站對19 條HD-Zip 成員的蛋白進(jìn)行無序區(qū)域預(yù)測，并用WPS 以及Excel 對其蛋白質(zhì)的無序區(qū)以及有序區(qū)的氨基酸數(shù)目進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計，以便后續(xù)分析（其中由于Dlo-026005.1、Dlo-027079.2 的蛋白質(zhì)中含有部分未知氨基酸序列，故不進(jìn)行后續(xù)分析）。

2 結(jié)果與分析

2.1 無序區(qū)域的特征

注：（Ala丙氨酸）Alanine、（半Cys胱氨酸）Cysteine、（Asp天冬氨酸）Aspartic acid、（Glu谷氨酸）Glutamic acid、 （Phe苯丙氨酸）Phenylalanine、（Gly甘氨酸）Glycine、（組His氨酸）、Histidine（Ile異亮氨酸）Isoleucine、（賴Lys氨酸）、Lysine（Leu亮氨酸）Leucine、（蛋Met氨酸）Methionine、（Asn天冬酰胺）Asparagine、（Pro脯氨酸）Proline、（Gln谷氨酰胺）、Glutamine（Arg精氨酸）Arginine、（絲Ser氨酸）Serine、（蘇Thr氨酸）Threonine、（纈Val氨酸）Valine、（Trp色氨酸）Tryptophan、（酪Tyr氨酸）Tyrosine。 下同。表1 龍眼HD-Zip 蛋白中無序區(qū)的氨基酸分布（Disordered）基因名[14]ID Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr氨基酸數(shù)目總蛋白序列長度占全部蛋白序列的比例∥%DLHB2-1 DLHB3-1 Dlo_032045.1 Dlo_032917.22 60 23 65 22 08 44 34 04 14 73 010 36 67 65 218 95 106 50 04 3100 7525686739.0625008.650519 DLHB3-3 DLHB3-4 Dlo_018995.1 Dlo_030526.17 31 15 22 20 05 63 20 21 15 33 22 36 44 32 29 98 54 20 00 067 528108218.2716056.333739 DLHB4-1 DLHB4-2 Dlo_016699.2 Dlo_022443.15 72 04 315 88 111 42 36 47 210 515 49 217 1010 36 219 65 67 00 03 1161 7184361919.09845811.470113 DLHB4-3 DLHB4-4 Dlo_022441.1 Dlo_005643.15 00 06 42 03 25 102 18 43 05 93 23 110 92 52 14 103 20 30 01 167 647147139.3837548.976157 DLHB4-7 DLHB4-8 Dlo_031302.1 Dlo_017332.18 210 26 135 75 415 324 34 64 47 125 48 144 134 57 1514 192 64 61 01 1108187744198714.5161299.411173 DLHB4-9 Dlo_009359.15179264304484631234018664513.333333 DLHB1-1 DLHB1-2 Dlo_027392.1 Dlo_002458.11 01 08 07 22 05 42 14 16 13 21 04 23 00 43 28 06 22 11 00 167 2320522532.68292710.222222

通過DISOPRED3 對龍眼HD-Zip 成員的蛋白進(jìn)行無序區(qū)域的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)19 個龍眼HD-Zip 成員中共有15 個成員的蛋白具有無序區(qū)域，并且這些蛋白的無序區(qū)域都是由連續(xù)30 個以上的氨基酸組成。按照固有無序蛋白的分類，此類蛋白質(zhì)應(yīng)屬于部分無序的固有無序蛋白[15]。其中，預(yù)測結(jié)果中龍眼HD-Zip 蛋白的無序區(qū)又根據(jù)是否具有蛋白質(zhì)的結(jié)合位點分為Disordered 與Disordered，portein binding。對其中13 個成員（除Dlo-026005.1、Dlo-027079.2）無序區(qū)的這2 種情況的氨基酸分布進(jìn)行統(tǒng)計（表1～2）。結(jié)果表明：首先，龍眼HD-Zip 蛋白的Disordered 的氨基酸總數(shù)大于Disordered，portein binding，其中Disordered 的氨基酸總數(shù)為1128，Disordered，portein binding 的氨基酸總數(shù)為593，可見無序區(qū)域中存在參與蛋白質(zhì)結(jié)合位點的區(qū)域約為全部無序區(qū)域的1/3；其次，13 個龍眼HD-Zip 在Disordered區(qū)域各成員具有的氨基酸種類為12-19，在Disordered，portein binding 各成員具有的氨基酸種類也為12-19，但從整體氨基酸分布的情況上來看，Disordered 區(qū)域相較于Disordered，portein binding 氨基酸的種類在分布上更加豐富；通過計算每個成員蛋白中Disordered 與Disordered，portein binding 區(qū)域序列所占的比例發(fā)現(xiàn)，同一亞家族的含量相近（除DLHB1-1 與DLHB1-2 存有一定的差異），猜測無序區(qū)域的形成以及無序區(qū)域的大小可能與蛋白的結(jié)構(gòu)域有著一定的聯(lián)系。

%白∥蛋例部比全的占列9.75609832.00000021.8750004.1522494.6913587.3081614.6263357.9159947.8431377.1528756.3172041.6104685.736434序白度蛋長205225256867810821843619714713744645總列序1987酸基目 207256 36 38603949 56 51473237氨數(shù)Tyr 031 0 1100 1 1110 Trp 010 0 0000 0 0000），portein binding Val 061 1 1141 0 1123 Thr 367 2 1632 1 4210 Ser 2107 5 61059 9 11321（Disordered Arg 122 1 3115 3 5211 Gln 120 4 0310 1 1201布Pro 141 3 0320 0 0310分酸65 2 3565 5 2534 Asn 13基氨的Met 33 3 2201 2 1131區(qū)序43 2 3610 2 0212無Leu 0中白Lys 040 1 2312 4 2002蛋HD-Zip Ile 221 2 0023 2 01161 His 001 1 132 3 4102眼龍Gly 110 5 54454426 8 1210表Phe 033 0 1100 1 1111 Glu 155 1 1153 5 1763 Asp 223 1 3414 3 4334 Cys 001 0 1111 1 0100 Ala 242 2 4515 5 1122 ID Dlo_027392.1 Dlo_002458.1 Dlo_032045.1 Dlo_032917.2 Dlo_018995.1 Dlo_030526.1 Dlo_016699.2 Dlo_022443.1 Dlo_022441.1 Dlo_005643.1 Dlo_031302.1 Dlo_017332.1 Dlo_009359.1名因基DLHB1-1 DLHB1-2 DLHB2-1 DLHB3-1 DLHB3-3 DLHB3-4 DLHB4-1 DLHB4-2 DLHB4-3 DLHB4-4 DLHB4-7 DLHB4-8 DLHB4-9

為分析在龍眼HD-Zip 蛋白無序區(qū)域中哪些氨基酸種類有促進(jìn)無序區(qū)域中蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域的組成，對20 種氨基酸在無序區(qū)域的含量進(jìn)行統(tǒng)計。從氨基酸的傾向性來分析（表3）可以發(fā)現(xiàn)：Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Met、Asn、Arg、Ser、Thr、Tyr 這12 種氨基酸在Disordered，portein binding 區(qū)域的含量較高，其中Gly 表現(xiàn)出最強(qiáng)的傾向性。說明這12 種氨基酸較傾向于無序區(qū)中蛋白結(jié)合位點的序列組成。

2.2 氨基酸偏好性特征

表3 龍眼HD-Zip 蛋白無序區(qū)域氨基酸含量

對上述13 個龍眼HD-Zip 成員蛋白質(zhì)的無序區(qū)以及有序區(qū)的氨基酸統(tǒng)計表明，無序區(qū)氨基酸的總數(shù)為1721，約占蛋白質(zhì)全部序列的18.2%，因此有序區(qū)的氨基酸總數(shù)約為無序區(qū)的4.5 倍?？梢?，龍眼HD-Zip 蛋白的有序區(qū)氨基酸總數(shù)要大大高于無序區(qū)域，龍眼HD-Zip 蛋白質(zhì)主要還是以有序區(qū)為主。

為分析氨基酸在龍眼HD-Zip 蛋白中的偏好性，對無序區(qū)以及有序區(qū)的不同氨基酸含量進(jìn)行統(tǒng)計，并且計算有序區(qū)與無序區(qū)之間各類氨基酸的含量（表4），可以看出，在龍眼HD-Zip 蛋白中Asp、Gly、His、Met、Asn、Pro、Ser、Thr這幾種氨基酸在無序區(qū)的含量高于有序區(qū)，表明這8 種氨基酸有利于無序區(qū)的組成；而Ala、Cys、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Gln、Arg、Val、Trp、Tyr 則在有序區(qū)的含量高于無序區(qū)，表明這12 種氨基酸在一定程度上比較有利于有序區(qū)域的組成。在20 種氨基酸中，Gly 最有利于龍眼HD-Zip 蛋白中無序區(qū)域的組成，其在無序區(qū)域的含量與有序區(qū)域大約相差5.637288 個百分點；而Leu 則最有利于龍眼HD-Zip蛋白中有序區(qū)域的組成，其在有序區(qū)的含量比無序區(qū)高出了4.114621 個百分點?？梢娫邶堁跦D-Zip 中，20 種氨基酸對無序區(qū)域以及有序區(qū)域的形成各有所偏向。

表4 龍眼HD-Zip 蛋白有序區(qū)及無序區(qū)的氨基酸含量對比

3 討論

3.1 龍眼HD-Zip 固有無序蛋白可能通過分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與應(yīng)激反應(yīng)

通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)，19 個龍眼HD-Zip 成員中15 個成員為固有無序蛋白。據(jù)悉，固有無序蛋白通過分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與植物對逆境的脅迫和適應(yīng)。同時，HD-Zip 轉(zhuǎn)錄因子在植物的應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[9，16]。因此猜測龍眼HD-Zip 固有無序蛋白可能參與應(yīng)激反應(yīng)并且存在分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)以往的研究報道[12]，固有無序蛋白的分子調(diào)控具有多種模式。其中，與完全無序的蛋白質(zhì)相比，部分無序蛋白中的有序區(qū)域可能起到了結(jié)合特定的DNA 序列，啟動光信號等作用。同時部分無序蛋白又根據(jù)無序區(qū)與有序區(qū)是否存在分子內(nèi)的相互作用分為兩類。分子間不存在明顯相互作用的蛋白，其無序區(qū)可能與其他的蛋白質(zhì)相互作用，有序區(qū)在此過程中起協(xié)作作用。分子間存在明顯相互作用時，又存在3 種情況：其一，無序域可在有序域釋放活性位點；其二，無序域可從有序區(qū)域中釋放出來從而與其他蛋白相互作用；其三，無序區(qū)域在有序區(qū)域與無序區(qū)域同時釋放活性位點，進(jìn)而與其他蛋白相互作用。這些分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在植物的非生物脅迫、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用。據(jù)報道，轉(zhuǎn)錄因子NAC[17]、HY5[18]存在第一類分子調(diào)控模式；GRAS[19]、CRY[20]存在第二類分子調(diào)控模式。至于龍眼HD-Zip 中固有無序蛋白通過哪種分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與應(yīng)激反應(yīng)，還需后續(xù)進(jìn)一步探究。

3.2 龍眼HD-Zip 固有無序蛋白具有氨基酸偏好性

對具有完整氨基酸序列的13 個成員進(jìn)行無序區(qū)域特征的分析發(fā)現(xiàn)，龍眼HD-Zip 存在固有無序區(qū)域，且在這些無序區(qū)域中存在蛋白質(zhì)結(jié)合位點。此前有研究者對IDPs與其他蛋白的結(jié)合位點殘基做了分析，其認(rèn)為疏水性、側(cè)鏈凈電荷量較少、極性較小、溶劑可及性表面積較大、側(cè)鏈體積較大、極化率較大的氨基酸殘基比較有利于IDPs 與蛋白質(zhì)作用位點的形成[3]。而該研究未對此做深入分析，龍眼HD-Zip 固有無序蛋白的作用位點殘基是否也具有這些特點，值得后續(xù)更加深入地分析。

對龍眼HD-Zip 蛋白的有序區(qū)域以及無序區(qū)域的氨基酸含量進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果表明在龍眼HD-Zip 蛋白的氨基酸序列中，Asp、Gly、His、Met、Asn、Pro、Ser、Thr 促進(jìn)無序區(qū)域的 形 成，Ala、Cys、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Gln、Arg、Val、Trp、Tyr 促進(jìn)有序區(qū)域的形成。早前，Radivojac 對固有蛋白的氨基酸偏好性做了分析，他認(rèn)為Phe、Val、Leu、His、Thr、Cys、Trp、Tyr、Ile、Asn 這幾種氨基酸相對促進(jìn)有序結(jié)構(gòu)的形成；Asp、Met、Lys、Arg、Ser、Gln、Pro、Glu 則促進(jìn)無序區(qū)域的形成；Ala 和Gly 則表現(xiàn)中性[21]。通過對比發(fā)現(xiàn)，該研究和Radivojac 都認(rèn)為Cys、Trp、Tyr、Ile、Phe、Val、Leu 促進(jìn)有序區(qū)域的形成；Asp、Met、Ser、Pro 促進(jìn)無序區(qū)域的形成。但仍存在一些不同，筆者認(rèn)為His、Thr、Asn 促進(jìn)無序區(qū)域的形成，而Radivojac 認(rèn)為其促進(jìn)有序區(qū)域的形成；筆者認(rèn)為Lys、Arg、Glu、Gln 促進(jìn)有序區(qū)域的形成，而Radivojac 認(rèn)為是促進(jìn)無序區(qū)域的形成。猜測形成這種差異的原因可能是：其一，該研究選取的范圍較小，僅為龍眼HD-Zip 成員；其二，對固有無序蛋白的預(yù)測方法有所不同。

4 展望

本次預(yù)測固有無序蛋白的工具為DISOPRED3，其相較于上一代DISOPRED2 更加準(zhǔn)確[13]。除此之外，還有PONDR VL3[22]、POODLE-L[23]等一些計算機(jī)預(yù)測軟件。通過試驗的方法預(yù)測無序蛋白的結(jié)構(gòu)存在諸多困難，比如費用高昂、需要花費大量時間，因此預(yù)測軟件的發(fā)展在固有無序蛋白的研究上顯得尤為重要。但目前固有無序蛋白的預(yù)測還存在許多局限之處，如預(yù)測的精確和準(zhǔn)確程度。據(jù)日前報道[24]，人們已經(jīng)利用AI 技術(shù)，進(jìn)行了蛋白3D 結(jié)構(gòu)的預(yù)測：谷歌“深度思維”（DeepMind）公司將人工智能“阿法狗”轉(zhuǎn)型，研究出一種“阿法折疊”（AlphaFold）的程序，成功根據(jù)基因序列預(yù)測出蛋白質(zhì)的3D 結(jié)構(gòu)。以此趨勢，未來人工智能必定在蛋白的研究與發(fā)展中起到更加重要的作用，無序蛋白的精準(zhǔn)預(yù)測也將指日可待。