黃立華

摘要 ? ?本文以蘋(píng)果矮化砧木為對(duì)象，簡(jiǎn)要綜述了其研究進(jìn)展和在組織培養(yǎng)過(guò)程中的主要影響因素，并對(duì)組織培養(yǎng)過(guò)程中存在的問(wèn)題進(jìn)行了闡述，以期為蘋(píng)果矮化砧木快繁提供借鑒。

關(guān)鍵詞 ? ?蘋(píng)果矮化砧木;組培快繁;影響因素;問(wèn)題

中圖分類(lèi)號(hào) ? ?S661.1 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ? ?A

文章編號(hào) ? 1007-5739（2020）12-0114-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

蘋(píng)果矮化密植栽植已成為當(dāng)今世界蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)發(fā)展和研究的主流，而其主要方式是利用矮化砧木[1-3]。當(dāng)前生產(chǎn)上主要有矮化中間砧和自根砧2種類(lèi)型，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，后者擁有整齊度高、早果性、產(chǎn)量高、品質(zhì)好等諸多優(yōu)勢(shì)[2];生產(chǎn)上后者的繁殖方式主要有壓條、扦插和組織培養(yǎng)等3種，與前2種繁殖方式對(duì)比發(fā)現(xiàn)，組織培養(yǎng)擁有繁殖系數(shù)大、周期較短、不受季節(jié)約束、苗整齊度高以及節(jié)省育苗用地等優(yōu)點(diǎn)[3-5]。因此，本文以矮化蘋(píng)果自根砧為研究對(duì)象，介紹其組織培養(yǎng)研究進(jìn)展，以及主要影響因素和培養(yǎng)過(guò)程中存在的問(wèn)題，以期為生產(chǎn)上蘋(píng)果矮化自根砧的快繁提供理論依據(jù)。

1 ? ?蘋(píng)果矮化自根砧的組培研究進(jìn)展

在20世紀(jì)60年代，研究者通過(guò)矮化自根砧的莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到了其再生植株，在20世紀(jì)80年代，組織培養(yǎng)在蘋(píng)果砧木快繁上得到了較快的發(fā)展[4-5]。

我國(guó)蘋(píng)果砧木組培快繁的研究工作起源于20世紀(jì)70年代，于1977年通過(guò)利用M7和M9 2種蘋(píng)果砧木的新梢作為研究材料，對(duì)枝段的莖尖進(jìn)行離體培養(yǎng)，突破性地獲得了移栽的組培苗[3-5];而快速發(fā)展階段是在80年代中后期[5-6];目前，多數(shù)品種和砧木的器官已經(jīng)能夠進(jìn)行工廠化育苗。蘋(píng)果矮化自根砧繁殖主要采用組織培養(yǎng)快速繁殖，雖然此種方式對(duì)技術(shù)要求較高，但其諸多優(yōu)點(diǎn)使其在蘋(píng)果矮化自根砧的快速返回和無(wú)病毒苗培育上有較為廣泛的應(yīng)用[3-5]。

2 ? ?蘋(píng)果矮化自根砧組培的主要影響因素

2.1 ? ?基因型

基因型不同是較主要的影響因素。研究發(fā)現(xiàn)，相同品種在不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最終表現(xiàn)不同;不同品種在相同培養(yǎng)條件下表現(xiàn)也不同。因此，需要對(duì)不同蘋(píng)果砧木類(lèi)型的組培快繁進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究[7]。通過(guò)對(duì)奧查金、美鈴、新紅星蘋(píng)果進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其生長(zhǎng)分化的情況有顯著差異，首先從分化指數(shù)可以看出差別;此外，瓶?jī)?nèi)材料的長(zhǎng)勢(shì)情況差異較大，從優(yōu)到差依次為奧查金>美鈴>新紅星[8]。

2.2 ? ?基本培養(yǎng)基

研究表明，MS培養(yǎng)基（附加瓊脂+蔗糖，濃度分別為6 g/L和30 g/L）為較多蘋(píng)果砧木組織培養(yǎng)常用的基質(zhì)[4];另外有研究發(fā)現(xiàn)，GM256和M26砧木材料在增殖生長(zhǎng)過(guò)程中，最佳的基質(zhì)為QL[9-10];師校欣等發(fā)現(xiàn)，首紅試管苗采用的是改良的C17作為基本培養(yǎng)基[11]。

2.3 ? ?植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑主要有細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素和赤霉素等[4，12]，其中細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素是在組織培養(yǎng)誘導(dǎo)和繼代過(guò)程中發(fā)揮作用的調(diào)節(jié)劑[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素是在細(xì)胞分裂、不定芽分化和莖的分化等過(guò)程中起作用的[12-13]，而當(dāng)培養(yǎng)基中添加此種調(diào)節(jié)劑，可以起到推動(dòng)細(xì)胞的分裂、器官或愈傷組織可以產(chǎn)生不定芽[12];此外，此種調(diào)節(jié)劑還能夠抑制頂端優(yōu)勢(shì)，從而使腋芽萌發(fā)，因而也可以用于增殖[12];在蘋(píng)果矮化砧木組織培養(yǎng)進(jìn)程中用到的此類(lèi)調(diào)節(jié)劑常常有玉米素、6-芐基腺嘌呤和激動(dòng)素（分別為ZT、6-BA和KT）等一類(lèi)嘌呤的衍生物[12-13]。

生長(zhǎng)素在蘋(píng)果矮化砧木組織培養(yǎng)過(guò)程中的功能是促使外植體進(jìn)行脫分化以及促進(jìn)細(xì)胞開(kāi)始分裂生長(zhǎng)，另外還起到對(duì)根的分化進(jìn)行誘導(dǎo)的功能[4]。研究和生產(chǎn)上經(jīng)常使用的此類(lèi)調(diào)節(jié)劑有IBA、NAA、IAA，它們的活性強(qiáng)弱順序?yàn)镹AA>IBA>IAA[12]。

研究表明，在蘋(píng)果矮化砧木離體的莖尖頂端分生組織中，生長(zhǎng)激素不能自我產(chǎn)生，需人為提供細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素，其主要作用是促使莖尖的生長(zhǎng)分化[14]。研究發(fā)現(xiàn)，2種激素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)分化具有協(xié)同作用，其不同配比和不同量對(duì)細(xì)胞分化產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用不同[14]。另外，繼代培養(yǎng)成功的重要因素是激素的類(lèi)型和質(zhì)量濃度[7];研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)、濃度以及不同的組合能夠使組織、器官的發(fā)育和分化方向有差異[15]。前人研究發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果矮化砧木使芽分化誘導(dǎo)的最佳調(diào)節(jié)劑為6-BA，濃度為0.5～2.0 mg/L;繼代和增殖培養(yǎng)時(shí)，最佳的調(diào)節(jié)劑為6-BA 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.01～0.10 mg/L;生根培養(yǎng)時(shí)，最佳調(diào)節(jié)劑為IAA 1.0～1.5 mg/L [16-17]。此外，對(duì)蘋(píng)果砧木組培快繁研究發(fā)現(xiàn)，品種和研究者的不同導(dǎo)致激素類(lèi)型和濃度有所差異，對(duì)于相同的蘋(píng)果砧木而言，研究者的不同使研究的結(jié)論也不盡相同[9，12，18-22]。

2.4 ? ?培養(yǎng)條件

在蘋(píng)果矮化砧木組培快繁中，培養(yǎng)條件的影響因素有多種，其中主要影響因素為光照和溫濕度[4，12，23]。研究發(fā)現(xiàn)，通常情況下，培養(yǎng)室的光照時(shí)間、光照強(qiáng)度分別為12～16 h/d、1 000～5 000 lx[4，23];另外，黑暗條件可以使細(xì)胞和愈傷組織的增殖效果顯著，但器官分化則需要適宜的光照[12，23]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫濕度過(guò)高和過(guò)低時(shí)，都不利于植物的生長(zhǎng)，在蘋(píng)果矮化砧木組培快繁中要求的溫度為25 ℃左右，濕度保持為70%～80%[4-5]。此外，高溫高濕可能導(dǎo)致試管苗玻璃化[4]。

3 ? ?褐化及玻璃化問(wèn)題

3.1 ? ?褐化問(wèn)題

蘋(píng)果矮化自根砧外植體褐化是影響其組培快繁的主要因素，組培一般采用HgCl2和乙醇配合的方法滅菌，以達(dá)到無(wú)菌的狀態(tài)，在此過(guò)程中易出現(xiàn)嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象[4-5]。

研究表明，褐化的產(chǎn)生與品種、取材時(shí)間、消毒時(shí)間、激素水平、取材部位、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件以及外植體的年齡和大小等都有一定關(guān)系[4，12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，基因型是褐變產(chǎn)生的最關(guān)鍵原因[4];木本植物體內(nèi)酚類(lèi)物質(zhì)處于高水平時(shí)，褐化幾率較大;外植體樹(shù)齡大，其木質(zhì)素含量高，易褐化;外植體較小時(shí)，也易褐化[12];此外，處于生長(zhǎng)季節(jié)的外植體中含有較多的多酚氧化物，也較易發(fā)生褐化[4]。木質(zhì)化程度和代謝活動(dòng)不同的外植體，其褐化程度也不同;高溫、高濃度的細(xì)胞分裂素或無(wú)機(jī)鹽也易導(dǎo)致褐化[4，24]。

因?yàn)楹只瘜?duì)蘋(píng)果矮化砧木組培快繁影響較大，所以相應(yīng)的防止研究較多。研究表明，低溫可以抑制酚類(lèi)物質(zhì)氧化，從而降低多酚氧化酶活性，進(jìn)而降低外植體的褐化率[4-5];梁海永等對(duì)阿月渾子采用暗培養(yǎng)后光培養(yǎng)以減輕褐化[25];選擇適宜的取材時(shí)間[4]、取材部位[26]及取較大外植體[24]也有利于抑制褐化。研究發(fā)現(xiàn)，核桃在春秋季取材較夏季取材褐化減輕[24];10年以上成年樹(shù)側(cè)芽易發(fā)生褐化，而1～3年實(shí)生苗則褐化發(fā)生較遲[26];加入Na2S2O3的培養(yǎng)基能夠減少核桃外植體產(chǎn)生褐化現(xiàn)象[27]。此外，添加褐化抑制劑（如抗壞血酸、半胱甘肽、乙二酸四乙酸等[26]）或吸附劑（活性炭、聚乙烯吡咯烷酮）能夠抑制酚類(lèi)進(jìn)行氧化，進(jìn)而減輕褐化的產(chǎn)生[26]。

3.2 ? ?玻璃化

此種問(wèn)題的蘋(píng)果矮化砧木組培苗呈現(xiàn)的形態(tài)是半透明狀和外觀異常[4-5]，表現(xiàn)為葉片皺縮和卷曲、脆弱易破碎、顏色不正、分化能力低、移栽成活率低等[3-5]。因此，蘋(píng)果矮化自根砧組培中的玻璃化現(xiàn)象為其快繁過(guò)程中的又一難題。

導(dǎo)致蘋(píng)果矮化自根砧組培苗玻璃化的原因有很多，其中基因型是導(dǎo)致其發(fā)生的主要原因;其次直接導(dǎo)致其發(fā)生的原因有環(huán)境濕度、外植體的類(lèi)型和高的培養(yǎng)基水勢(shì);再有能夠?qū)е缕浒l(fā)生的原因有培養(yǎng)基中不適宜的碳源、無(wú)機(jī)鹽或離子;還有就是6-BA可以致使玻璃化的產(chǎn)生[2-4]，通過(guò)對(duì)M7蘋(píng)果砧木和富士蘋(píng)果研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)中6-芐基腺嘌呤濃度高則玻璃化率就高，當(dāng)濃度為0.5 mg/L和1.5 mg/L時(shí)，所發(fā)生的比例分別為10%和50%[28];此外，培養(yǎng)條件的不適合，也是產(chǎn)生玻璃化苗的原因[3-5]。

對(duì)于組培快繁中防止玻璃化的產(chǎn)生，也有較深的研究。當(dāng)外植體類(lèi)型選擇合適時(shí)，玻璃化率就會(huì)大幅降低，通過(guò)對(duì)瑞香不同外植體類(lèi)型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其中部莖段玻璃化率高達(dá)100%，而其基部和莖尖則較低[29]。調(diào)整培養(yǎng)基中碳源、無(wú)機(jī)鹽或離子也能夠在一定程度上使玻璃化的發(fā)生幾率降低。張翠玉等[30]對(duì)月季玻璃化率研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中缺少或減少硝酸銨時(shí)，其發(fā)生率顯著降低;當(dāng)鹽的濃度適宜時(shí)，能夠使玻璃化的產(chǎn)生幾率降低;另外，K+或Ca2+也能夠降低玻璃化的發(fā)生幾率[31]。針對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑尤其是6-BA易導(dǎo)致玻璃化發(fā)生的原因，研究發(fā)現(xiàn)，可降低其濃度來(lái)防止或減輕玻璃化的產(chǎn)生[28]。研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)瓊脂的濃度提高時(shí)，玻璃化的產(chǎn)生幾率也會(huì)降低[32];水分脅迫劑（PVA）的加入也能夠使玻璃化的產(chǎn)生幾率降低[28]。

4 ? ?參考文獻(xiàn)

[1] 王婷婷，胡春宏，常蘋(píng)，等.蘋(píng)果矮化砧木品種Bud9組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2019，39（19）：27-29.

[2] 周莉.蘋(píng)果矮化砧木離體培養(yǎng)和快繁體系建立與優(yōu)化[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2017.

[3] 趙勤，張貞，徐金.目前國(guó)內(nèi)蘋(píng)果矮化出現(xiàn)的問(wèn)題與對(duì)策[J].林業(yè)科技通訊，2016（6）：17-19.

[4] 王淼淼.幾種新型蘋(píng)果矮化砧木的組培快繁技術(shù)研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[5] 楊艷敏，魏永祥，劉成，等.蘋(píng)果矮化砧木組織培養(yǎng)及脫病毒技術(shù)[J].北方園藝，2016（4）：107-112.

[6] 韓靜.幾種無(wú)性繁殖方式對(duì)蘋(píng)果砧木生根的影響[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2015.

[7] 杜學(xué)梅，李登.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在蘋(píng)果組培上的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2002（4）：75-79.

[8] 師校欣，高儀，馬寶昆，等.蘋(píng)果莖尖培養(yǎng)中無(wú)菌繁殖系建立的研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997（2）：45-49.

[9] 孫清榮，孫洪雁，李林光，等.蘋(píng)果矮化砧GM256高效快繁技術(shù)體系的建立[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（7）：95-99.

[10] 孫清榮，關(guān)秋竹，王海波，等.蘋(píng)果抗寒矮化砧木‘BP-176的組織培養(yǎng)及其葉片不定梢誘導(dǎo)[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2019，36（6）：812-818.

[11] 師校欣，高儀，馬寶焜.“首紅”蘋(píng)果莖尖培養(yǎng)及快速繁殖[J].植物生理學(xué)通迅，1996（6）：42.