卓澤銘，范忠誠，郭 祥

（中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院骨科，海南?？?70208）

骨關節(jié)炎是一種以關節(jié)軟骨退化、滑膜炎癥、軟骨下骨增厚和骨贅形成為特征的慢性退行性關節(jié)疾病，是與關節(jié)創(chuàng)傷和衰老相關的最常見的關節(jié)疾病[1]。目前，骨關節(jié)炎藥物治療方案仍然有限，非藥物治療方案亦未得到充分利用[2]。因此，迫切需要擴大研究，以便更充分地探索基于骨關節(jié)炎機制的疼痛管理策略。桑寄生（Herba Taxilli，Sangjisheng，SJS）是桑寄生科植物桑寄生[Taxillus chinensis（DC.）Danser]的干燥帶葉莖枝，具有祛風濕、補肝腎、強筋骨、安胎元的功能，用于風濕痹痛、腰膝酸軟、筋骨無力、崩漏經(jīng)多、妊娠漏血、胎動不安、頭暈目眩等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，桑寄生水提物具有良好的抗炎活性[4]，桑寄生總黃酮對佐劑性關節(jié)炎大鼠足趾腫脹程度及全身癥狀具有明顯改善作用，顯現(xiàn)出明顯的祛風濕作用[5]。但桑寄生對骨關節(jié)炎軟骨細胞生物行為的影響及其機制目前還少有研究。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA，參與骨關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過程[6]。有研究對膝骨關節(jié)炎患者軟骨組織miRNA表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)miR-375在骨關節(jié)炎軟骨組織中高表達[7]，并發(fā)現(xiàn)miR-375在病變組軟骨祖細胞中表達上調(diào)[8]。miR-375對骨關節(jié)炎的影響目前尚不明確。基于此，本研究體外培養(yǎng)人原代骨性關節(jié)軟骨細胞RPOC，觀察桑寄生提取物對白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導的骨關節(jié)炎軟骨細胞生長和凋亡的影響，并結合miR-375對其潛在的作用機制進行初步探索。

材料和方法

1 主要試劑

桑寄生購自中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院；IL-1β和MTT購自Sigma-Aldrich；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；RIPA裂解液購自Solarbio；抗細胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體、抗P21抗體、抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗caspase-3抗體和抗GAPDH抗體購自Cellular Signaling Technology；辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗購自北京中杉金橋公司；異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶（annexinⅤ-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，annexin Ⅴ-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司；Trizol和Lipofectamine 2000購自Invitrogen；實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）相關檢測試劑盒購自TaKaRa；anti-miR-375、miR-375及各自陰性對照購自GenePharma。

2 方法

2.1 桑寄生提取物的制備 桑寄生提取物的制備參照管俊[9]的方法進行，即桑寄生藥材粉末用70%的乙醇以1∶20的料液比，在80℃條件下提取1.5 h，重復2次。合并2次濾液，濃縮干燥即得桑寄生提取物。

2.2 細胞分離、培養(yǎng)與分組 收集本院因下肢損毀性創(chuàng)傷（無骨關節(jié)炎病史）而進行全膝關節(jié)置換手術的廢棄組織標本，并經(jīng)患者或其家屬的知情同意，參照張慶等[10]的方法進行人原代骨性關節(jié)軟骨細胞RPOC的分離。對RPOC鑒定后發(fā)現(xiàn)，與文獻[10]所述一致，即細胞形態(tài)多呈圓形、橢圓形或短梭形，含豐富的胞漿，圓形胞核，核仁1～3個，呈“笑臉狀”，散狀生長，部分細胞融合生長。將分離的RPOC置于含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將第2代生長狀態(tài)良好的RPOC分為對照組（control組，細胞不用IL-1β處理），模型組（IL-1β組，10 μg/L IL-1β處理細胞[11]），SJS低劑量給藥組（IL-1β+SJS-L組，10 μg/L IL-1β和0.09 g/L桑寄生提取物處理細胞），SJS中劑量給藥組（IL-1β+SJS-M組，10 μg/L IL-1β和0.18 g/L桑寄生提取物處理細胞），高劑量給藥組（IL-1β+SJSH組，10 μg/L IL-1β和0.36 g/L桑寄生提取物處理細胞）。

2.3 MTT法檢測細胞活力 將RPOC密度調(diào)整為1×107/L，并接種于96孔板，培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后加入MTT溶液100 μL，37℃反應4 h，加入二甲基亞砜200 μL，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)10 min，于酶標儀檢測RPOC 490 nm下的吸光度（A）值。

2.4 Western blot檢測 cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達 利用RIPA裂解液提取RPOC中總蛋白，進行10%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，室溫下用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的抗cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax和caspase-3抗體，4℃孵育過夜。次日，TBST充分洗滌，加入II抗，孵育2 h，化學發(fā)光液顯色顯影，以GAPDH作為內(nèi)參照，分析cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達。

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞凋亡的檢測參照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒進行操作。收集RPOC 5×105個，懸浮后依次加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后室溫避光反應15 min，進行流式細胞儀的檢測。

2.6 qPCR檢測miR-375的表達 利用Trizol試劑提取RPOC總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行qPCR反應。miR-375的正向引物序列為5'-GGCTCTAGAGGGGACGAAGC-3'，反向引物序列為 5'-GGCAAGCTTTTTCCACACCTCAGCCTTG-3'；內(nèi)參照U6的正向引物序列為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。 通 過 2-ΔΔCt法計算miR-375表達。

2.7 細胞轉(zhuǎn)染實驗 轉(zhuǎn)染前24 h，將RPOC接種于6孔板。待細胞密度達約70%，利用Lipofectamine 2000試劑在細胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-375、miR-NC和miR-375。其中，轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、antimiR-375的細胞使用10 μg/L IL-1β進行處理，轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-375的細胞使用10 μg/L IL-1β和0.36 g/L桑寄生提取物處理。收集轉(zhuǎn)染48 h的細胞，按照上述方法檢測細胞活力、凋亡、miR-375、cyclin D1、P21、Bcl-2和Bax蛋白表達。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，結果表示為均數(shù)±標準差（mean±SD）。兩組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 桑寄生對IL-1β作用的RPOC活力的影響

MTT檢測結果顯示，與control組比較，IL-1β組24 h、48 h和72 h的RPOC活力明顯降低（P＜0.05）；與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-L組在24 h、48 h和72 h的RPOC細胞活力無顯著變化，IL-1β+SJS-M組和IL-1β+SJS-H組在24 h、48 h和72 h的RPOC細胞活力較IL-1β組顯著升高（P＜0.05），見表1。因此選用作用較為明顯的桑寄生提取物濃度0.36 g/L即SJS-H做后續(xù)實驗。

Western blot檢測結果發(fā)現(xiàn)，與control組比較，IL-1β組RPOC中cyclin D1的表達量明顯減少，P21的表達量顯著增加（P＜0.05）；與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-L組RPOC中cyclin D1和P21蛋白水平無明顯變化，IL-1β+SJS-M組和IL-1β+SJS-H組cyclin D1的表達量顯著增加，P21的蛋白水平明顯降低（P＜0.05），見圖1、表1。

Figure 1.The effect of SJS on the expression of proliferation related-proteins in RPOC treated with IL-1β.圖1 桑寄生對IL-1β作用的RPOC增殖相關蛋白表達的影響

表1 桑寄生對IL-1β作用下的RPOC中cyclin D1和P21蛋白表達及細胞活力的影響Table 1.Effects of SJS on cyclin D1 and p21 protein expression and cell viability of RPOC stimulated with IL-1β（Mean±SD.n=9）

2 桑寄生對IL-1β作用的RPOC凋亡的影響

流式細胞術檢測結果表明，與control組比較，IL-1β組RPOC的凋亡率明顯增加（P＜0.05）；與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-H組RPOC的凋亡率顯著降低（P＜0.05），見圖2A、表2。Western blot檢測結果顯示，與control組比較，IL-1β組RPOC的Bcl-2蛋白表達量明顯減少，Bax和caspase-3蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-H組RPOC的Bcl-2蛋白表達量明顯增加，Bax和caspase-3蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖2B、表2。

Figure 2.The effect of SJS on the apoptosis of RPOC treated with IL-1β.A：the images of flow cytometry for analyzing the effect of SJS on the apoptosis of RPOC treated with IL-1β；B：the images of Western blot for determining the effect of SJS on the expression of apoptotic proteins in the RPOC treated with IL-1β.圖2 桑寄生對IL-1β作用的RPOC凋亡的影響

表2 桑寄生對IL-1β作用的RPOC中miR-375表達水平和凋亡的影響Table 2.The effect of SJS on miR-375 expression and apoptosis of RPOC induced by IL-1β（Mean±SD.n=9）

3 桑寄生對IL-1β作用的RPOC中miR-375表達的影響

qPCR數(shù)據(jù)顯示，與control組比較，IL-1β組RPOC中miR-375的表達量明顯增加（P＜0.05）；與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-H組RPOC內(nèi)miR-375的表達量顯著減少（P＜0.05），見表2。

4 抑制miR-375對IL-1β作用的RPOC活力、增殖相關蛋白表達和凋亡的影響

與IL-1β+anti-miR-NC組比較，IL-1β+anti-miR-375組RPOC中miR-375表達量明顯減少（P＜0.05），cyclin D1和Bcl-2蛋白水平顯著升高，而P21、Bax和caspase-3蛋白的水平明顯減少（P＜0.05），24 h、48 h和72 h的細胞活力明顯升高（P＜0.05），并且細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），見圖3及表3～4。

Figure 3.The effect of miR-375 on the apoptosis of the RPOC and the expression of cyclin D1，P21 and apoptosis-related proteins in the RPOC.A：effect of anti-miR-375 on the apoptosis of RPOC treated with IL-1β；B：effect of anti-miR-375 on the protein levels of cyclin D1，P21 and apoptosis-related proteins in the RPOC treated with IL-1β.圖3 抑制miR-375對IL-1β作用的RPOC凋亡及其中cyclin D1、P21和凋亡相關蛋白表達的影響

表3 抑制miR-375對IL-1β作用的RPOC活力及增殖相關蛋白表達的影響Table 3.The effect of anti-miR-375 on the viability and prroliferation-related protein expression of RPOC treated with IL-1β（Mean±SD.n=9）

表4 抑制miR-375對IL-1β作用的RPOC凋亡的影響Table 4.Inhibitory effect of anti-miR-375 on the apoptosis of RPOC induced by IL-1β（Mean±SD.n=9）

5 過表達miR-375能逆轉(zhuǎn)桑寄生對IL-1β作用的RPOC活力和增殖相關蛋白表達的影響

與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-H組RPOC中miR-375和P21的表達量明顯減少，cyclin D1蛋白水平及24 h、48 h和72 h的細胞活力顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β+SJS-H+miR-NC組比較，IL-1β+SJS-H+miR-375組miR-375和P21的表達量明顯增加，cyclin D1蛋白水平及24 h、48 h和72 h的細胞活力顯著降低（P＜0.05），見圖4、表5。

6 過表達miR-375能逆轉(zhuǎn)桑寄生對IL-1β作用的RPOC凋亡的作用

與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-H組RPOC中Bax和caspase-3的蛋白水平及凋亡率明顯減少，Bcl-2蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β+SJS-H+miR-NC組比較，IL-1β+SJS-H+miR-375組RPOC中Bax和cas

pase-3的蛋白水平及凋亡率明顯增加，Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖5、表6。

Figure 4.Over-expression of miR-375 reversed the effect of SJS on the expression of cyclin D1 and P21 in the RPOC treated with IL-1β.圖4 過表達miR-375能逆轉(zhuǎn)桑寄生對IL-1β作用的RPOC中cyclin D1和P21蛋白表達的影響

表5 過表達miR-375能逆轉(zhuǎn)桑寄生對IL-1β作用的RPOC活力的作用Table 5.Over-expression of miR-375 reversed the effect of SJS on the viability of RPOC induced by IL-1β（Mean±SD.n=9）

討 論

Figure 5.Over-expression of miR-375 reversed the effect of SJS on the apoptosis of and the protein levels of apoptotic molecules in RPOC stimulated with IL-1β.圖5 過表達miR-375能逆轉(zhuǎn)桑寄生對IL-1β作用的RPOC凋亡及凋亡蛋白水平的影響

骨關節(jié)炎是一種慢性退行性疾病[12]，與年齡、性別和遺傳因素相關的代謝和炎癥因子通過破壞關節(jié)軟骨，進而導致骨關節(jié)炎。目前已確定多種導致骨關節(jié)炎進展的因素，包括參與骨關節(jié)炎發(fā)病機制的蛋白水解酶和炎性細胞因子[13]。在骨關節(jié)炎進展中，促炎細胞因子IL-1β通過刺激軟骨退化和觸發(fā)滑膜炎癥發(fā)揮關鍵的作用[14]。IL-1β作用于軟骨細胞后，導致軟骨細胞活力的降低和細胞凋亡的增加[15]。本研究采用IL-1β處理人原代骨性關節(jié)軟骨細胞RPOC，構建骨關節(jié)炎模型，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組的RPOC比較，IL-1β處理明顯降低24 h、48 h和72 h的細胞活力及cyclin D1、Bcl-2蛋白表達，并提高細胞凋亡率及P21、Bax和caspase-3的蛋白水平，與前人結果相符。本研究還對桑寄生作用于IL-1β處理的RPOC影響上述指標的機制進行了探索。

桑寄生是我國傳統(tǒng)中藥，含有黃酮類、揮發(fā)油類、維生素等化學成分，現(xiàn)代藥理研究表明，桑寄生具有抗炎、抗腫瘤、降血壓、降血脂、降血糖和抗氧化等活性[16]。研究表明，桑寄生浸膏對二甲苯刺激的小鼠耳腫脹具有明顯的緩解作用，并加速消退，效果與阿司匹林相當[17]。由桑寄生、熟地等藥材制成的熟地寄生壯骨方具有顯著的抗炎作用，可以有效改善大鼠膝關節(jié)腫脹度，并抑制IL-1和IL-6水平[18]。本研究中，IL-1β抑制RPOC增殖并誘導凋亡，而使用桑寄生提取物后，IL-1β作用的軟骨細胞RPOC的活力和凋亡情況與IL-1β組相反，即桑寄生提取物顯著提高細胞活力、cyclin D1、Bcl-2蛋白表達，降低細胞凋亡率、P21、Bax、caspase-3蛋白的水平（P＜0.05），顯示出對IL-1β誘導的軟骨細胞的保護作用。

本實驗的qPCR數(shù)據(jù)顯示，IL-1β使RPOC中miR-375表達量明顯增加，而加入桑寄生提取物后，miR-375表達量顯著減少，提示桑寄生保護IL-1β刺激的軟骨細胞與可能調(diào)控miR-375表達有關。miRNA是一類由22～25個核苷酸組成的非編碼RNA分子，它通過促進降解、抑制翻譯或其它機制，成為基因表達的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子[19]。已有證據(jù)表明，miRNA，如miR-34a和miR-181a[20]參與骨關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程。miR-375作為一種潛在的腫瘤抑制基因，已被證實在多種人類惡性腫瘤包括乳腺癌[21]、肺腺癌[22]和骨肉瘤[23]中下調(diào)。miR-375-3p及其靶點可能作為骨質(zhì)疏松癥診斷的生物標志物，也可能作為骨質(zhì)疏松癥治療的新型藥物[24]。但miR-375對骨關節(jié)炎的影響尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-375顯著減少IL-1β作用的RPOC中miR-375和P21、Bax、caspase-3蛋白的水平及細胞凋亡率，明顯提高cyclin D1、Bcl-2蛋白水平、細胞活力。過表達miR-375能逆轉(zhuǎn)桑寄生對IL-1β作用的RPOC活力的促進作用和對細胞凋亡的抑制作用，提示桑寄生促進IL-1β誘導的RPOC生長并抑制其凋亡可能與調(diào)控miR-375表達有關。

表6 過表達miR-375能逆轉(zhuǎn)桑寄生對IL-1β作用的RPOC凋亡的作用Table 6.Over-expression of miR-375 reversed the effect of SJS on the apoptosis of RPOC treated with IL-1β（Mean±SD.n=9）

總之，桑寄生提取物可以促進IL-1β作用的人原代骨性關節(jié)軟骨細胞的活力，并抑制細胞凋亡，其作用機制與調(diào)控miR-375表達有關。這一結果為骨關節(jié)炎的治療提供了新的線索和潛在的靶點。