封寶紅，伍 軍，張艷霞，朱戈麗，鞏雪敏，畢智敏，胡曼莉

（武漢市第三醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北武漢430060）

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是慢性腎臟病最常見的并發(fā)癥之一。隨著我國(guó)居民生活水平的提高和方式的改變，HUA患病率逐年上升，發(fā)展為我國(guó)重要的公共衛(wèi)生問題之一[1]。我國(guó)慢性腎臟病患者的HUA患病率為36.6%～50.0%，且HUA成為腎功能進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。HUA具有體內(nèi)嘌呤代謝紊亂、尿酸增高等病理特征，當(dāng)尿酸在腎臟中長(zhǎng)期積累，可造成腎實(shí)質(zhì)損傷，稱為尿酸性腎病[3-4]。近年來，線粒體功能障礙在急性腎病和慢性腎病中的重要性受到越來越多人的重視[5-7]。研究顯示，線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）穩(wěn)定性與人類多種疾病相關(guān)[8]。受損的線粒體將其DNA釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，血清和尿中mtDNA水平可能是腎臟疾病的生物標(biāo)志物[9]。前期研究結(jié)果顯示，尿酸引起的大鼠腎小管上皮細(xì)胞損傷中，胞內(nèi)線粒體功能障礙，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）增加，膜電位降低，細(xì)胞凋亡增加[10]。磷酸甘油酸變位酶家族成員 5（phosphoglycerate mutase family member 5，Pgam5）作為一種線粒體蛋白，在細(xì)胞凋亡和壞死過程中起關(guān)鍵作用，可介導(dǎo)線粒體發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）參與調(diào)控細(xì)胞凋亡[11]。為了進(jìn)一步探討尿酸在腎細(xì)胞中引起損傷的機(jī)制，本研究將從線粒體損傷及Pgam5/Drp1表達(dá)變化的角度進(jìn)行闡述。

材料和方法

1 材料

大鼠腎細(xì)胞NRK-52E由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。DMEM培養(yǎng)基（HyClone）；胎牛血清（Gibco）；DMSO和尿酸（Sigma）；MTT、Hoechst 33258染液、兔抗Drp1抗體（用于免疫熒光染色和Western blot檢測(cè)）、兔抗Pgam5抗體（用于Western blot檢測(cè)）、兔抗GAPDH抗體和抗熒光淬滅封片液（Bioswamp）；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（BD）；兔抗Pgam5抗體（Biorbyt）；線粒體提取試劑盒（Solarbio）；細(xì)胞質(zhì)和核RNA提取試劑盒（Borgen Biotek）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；SYBR Green PCR試劑盒（KAPA Biosystems）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將細(xì)胞從液氮罐中取出，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1 000 r/min離心3 min，棄上清，加入1 mL DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶中，再加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，2～3 d換液1次。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度接種于96孔板中，每孔180 μL，每孔5×103個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞分為正常組和尿酸干預(yù)組，每組設(shè)置3復(fù)孔，分組干預(yù)后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。尿酸干預(yù)組處理：根據(jù)前期研究結(jié)果[7]，選擇濃度為0.6 mmol/L的尿酸干預(yù)。2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 分組處理細(xì)胞24 h后，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入20 μL濃度為5 g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，搖床低速振蕩15 min，充分溶解結(jié)晶物。酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各孔吸光度（A490），比較對(duì)照組和尿酸干預(yù)組的細(xì)胞活力。

2.3 Hoechst 33258染色 分組處理細(xì)胞24 h后，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min。棄固定液，PBS洗滌2次，加入少量Hoechst 33258染液，覆蓋細(xì)胞即可，染色5 min。棄染液，PBS洗滌5次，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及凋亡情況。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，收集至離心管中，1 000 r/min離心5 min。加入PBS重懸細(xì)胞，取5×105個(gè)細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min。棄上清，加入1 mL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，1 000 r/min 離心 5 min。棄上清，加入 200 μL binding buffer重懸細(xì)胞，加入10 μL Annexin V-FITC和 10 μL PI，混勻后，避光孵育 30 min。加入300 μL binding buffer，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2.5 透射電鏡觀察 收集消化后的細(xì)胞，PBS清洗2次，1 000 r/min離心5 min。PBS重懸，取1×106個(gè)細(xì)胞使用2.5%戊二醛4℃預(yù)固定45 min，再采用1%鋨酸固定。梯度乙醇脫水后，丙酮、環(huán)氧樹脂浸透，加入包埋劑，放入聚合包埋箱聚合。切成超薄切片，雙染法染色，送至武漢大學(xué)人民醫(yī)院電鏡室進(jìn)行透射電鏡觀察拍照。

2.6 RT-qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 采用線粒體提取試劑盒提取細(xì)胞線粒體：取5×107個(gè)細(xì)胞，冰浴研磨30～40次，將細(xì)胞勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中，10 000 r/min離心5 min，取上清；10 000 r/min離心5 min，取上清；12 000 r/min離心10 min，離心后的上清用于提取細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)蛋白，而管底沉淀為線粒體。再采用細(xì)胞質(zhì)和核RNA提取試劑盒提取線粒體RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Pgam5的正向引物序列為5’-ACCTGAAGAAAAGGAACG-3’，反向引物序列為5’-TCATAGAGGAATGGACGAT-3’；GAPDH的正向引物序列為5’-CAAGTTCAACGGCACAG-3’，反向引物序列為 5’-CCAGTAGACTCCACGACAT-3’。引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

2.7 免疫熒光染色 將各組細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，將1×108/L細(xì)胞接種至放有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)過夜。PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛固定30 min。PBS洗滌3次，加入0.5%Triton X-100室溫下通透20 min。PBS洗滌3次，加入5%BSA室溫封閉1 h，PBS洗滌后，取出蓋玻片，加入I抗稀釋液（抗Pgam5和Drp1抗體稀釋比1∶200），濕盒內(nèi)室溫孵育1 h。PBS洗滌3次，加入Alexa Fluor 594標(biāo)記的II抗稀釋液，室溫孵育1 h，PBS洗滌5次。取出一塊載玻片，滴加一滴含DAPI的抗熒光淬滅封片液，將蓋玻片貼在載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察。

2.8 Western blot檢測(cè)蛋白水平 提取各組細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)蛋白，定量后以20 μg蛋白上樣量進(jìn)行SDSPAGE。將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h。加入I抗（抗Pgam5、Drp1和GAPDH抗體稀釋比1∶1 000），室溫孵育1 h，PBS洗滌3次。加入HRP標(biāo)記的II抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次。將膜置于暗室中，滴加化學(xué)發(fā)光試劑，與膜充分接觸后，將膜置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖繪制。每組實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 尿酸對(duì)腎細(xì)胞活力的影響

MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，與正常組細(xì)胞比較，經(jīng)過尿酸干預(yù)24 h后的NRK-52E細(xì)胞的活力顯著降低（P＜0.01），見圖1。

Figure 1.The effect of uric acid on the viability of NRK-52E cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs normal group.圖1 尿酸對(duì)NRK-52E細(xì)胞活力的影響

2 尿酸對(duì)腎細(xì)胞形態(tài)及凋亡的影響

采用Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)正常組細(xì)胞大部分細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核呈均勻藍(lán)色熒光，出現(xiàn)極少濃染致密的細(xì)胞碎片，呈亮藍(lán)色，即為凋亡小體；尿酸干預(yù)組細(xì)胞形態(tài)異常，出現(xiàn)大量亮藍(lán)色細(xì)胞碎片，即凋亡小體增多，見圖2A。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了各組細(xì)胞凋亡水平，統(tǒng)計(jì)Q2-2和Q2-4細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示尿酸干預(yù)組細(xì)胞凋亡率顯著高于正常組（P＜0.01），見圖2B。

Figure 2.The morphological observation（A；×200）and apoptotic rate detection（B）of the NRK-52E cells after treated with uric acid.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs normal group.圖2 NRK-52E細(xì)胞形態(tài)觀察及凋亡率檢測(cè)

3 尿酸對(duì)腎細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡下觀察細(xì)胞線粒體形態(tài)變化，正常組細(xì)胞線粒體形態(tài)正常，嵴結(jié)構(gòu)完整；尿酸干預(yù)組線粒體腫脹、空泡化，且嵴結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)斷裂，見圖3。

Figure 3.The morphological changes of mitochondria in the NRK-52E cells treated with uric acid observed under transmission electron microscope（×5 000）.圖3 透射電鏡觀察NRK-52E細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

4 尿酸對(duì)腎細(xì)胞Pgam5和Drp1表達(dá)的影響

免疫熒光染色結(jié)果顯示，經(jīng)過尿酸干預(yù)后的NRK-52E細(xì)胞中Pgam5和Drp1陽性表達(dá)增加，見圖4。RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，尿酸干預(yù)組細(xì)胞線粒體中Pgam5的mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01），而細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中Pgam5和Drp1的蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.01），見圖5。

Figure 4.The expression of Pgam5 and Drp1 in the NRK-52E cells with immunofluorescence staining（×200）.圖4 NRK-52E細(xì)胞Pgam5和Drp1陽性表達(dá)的免疫熒光觀察

Figure 5.The mRNA expression of Pgam 5 in mitochondria（A）and the protein expression of Pgam 5 and Drp1 in cytoplasmic matrix（B）in theNRK-52E cells treated with uric acid.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs normal group.圖5 NRK-52E細(xì)胞線粒體Pgam5的mRNA表達(dá)及細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中Pgam5和Drp1的蛋白表達(dá)情況

討 論

細(xì)胞凋亡是一種自發(fā)性、程序性死亡過程，在人類健康和疾病中起著關(guān)鍵的作用[12]。細(xì)胞的凋亡是所有多細(xì)胞生物控制細(xì)胞增殖和維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，當(dāng)?shù)蛲鍪д{(diào)時(shí)可能導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[13]。本研究結(jié)果顯示，尿酸干預(yù)NRK-52E細(xì)胞后，細(xì)胞增殖率降低，凋亡率升高，細(xì)胞形態(tài)異常。細(xì)胞凋亡過程受多種通路調(diào)控，其中，細(xì)胞線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路為凋亡發(fā)生的主要機(jī)制之一[14]。為了進(jìn)一步了解尿酸引起腎細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，我們使用透射電鏡觀察細(xì)胞線粒體，發(fā)現(xiàn)尿酸干預(yù)使NRK-52E細(xì)胞線粒體出現(xiàn)空泡化，且嵴結(jié)構(gòu)受到破壞，而線粒體的形態(tài)變化、線粒體網(wǎng)絡(luò)的斷裂及線粒體嵴的重塑與細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)[15]，因此推測(cè)尿酸可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)腎細(xì)胞凋亡。

線粒體是一種多功能細(xì)胞器，可儲(chǔ)存能量并參與細(xì)胞多種應(yīng)激反應(yīng)過程，其本身也不斷受到ROS的刺激，而過度的ROS可引起蛋白質(zhì)修飾、mtDNA損傷等，最終導(dǎo)致線粒體功能障礙[16]。Pgam5是一種分子大小為32 kD的線粒體膜蛋白，研究顯示，Pgam5通過獨(dú)立促進(jìn)線粒體有絲分裂來保護(hù)細(xì)胞，避免細(xì)胞發(fā)生壞死[17]。而另一方面，線粒體應(yīng)激可導(dǎo)致內(nèi)源性Pgam5從受損的線粒體中釋放至細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，與其他蛋白結(jié)合發(fā)揮作用[18-19]。Pgam5可促進(jìn)Bax向線粒體易位和Drp1去磷酸化，形成的Bax-Pgam5-Drp1復(fù)合物是執(zhí)行線粒體內(nèi)源性細(xì)胞凋亡所必需的[20-21]。Drp1是發(fā)動(dòng)蛋白超家族的一種尿苷三磷酸（uridine triphosphate，GUP）酶，以二聚體和四聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，被線粒體外膜上的受體招募至線粒體，具有催化細(xì)胞內(nèi)線粒體分裂的作用[22]。Wang 等[23]免疫共沉淀結(jié)果顯示 Drp1 可與Bax結(jié)合，是Bax線粒體易位必需的結(jié)合蛋白。Bax線粒體轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致線粒體膜電位降低以及結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，引發(fā)下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)線粒體內(nèi)源性凋亡途徑的激活[24]。本研究結(jié)果顯示，尿酸干預(yù)后NRK-52E細(xì)胞線粒體中Pgam5 mRNA表達(dá)降低，而在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中Pgam5和Drp1蛋白表達(dá)顯著升高。

綜上所述，本研究結(jié)果提示尿酸誘導(dǎo)可腎細(xì)胞破壞線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)，上調(diào)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中Pgam5/Drp1表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，通過高濃度尿酸干預(yù)腎細(xì)胞模擬尿酸性腎病病理模型而探討尿酸干預(yù)機(jī)制將為尿酸性腎病的防治提供一定的理論基礎(chǔ)。值得注意的是，在Hoechst 33258染色中未觀察到尿酸處理后細(xì)胞核異?，F(xiàn)象，但在免疫熒光染色中發(fā)現(xiàn)個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核異常增大，因此推測(cè)尿酸可能對(duì)腎細(xì)胞核產(chǎn)生影響，但引起該變化的機(jī)制我們尚不清楚，將在進(jìn)一步的研究中進(jìn)行探討。