黎宏章 徐雪華 劉云惠 陳嬌娥 曾萬里 陳強

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是公認的胃炎、十二指腸潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤、胃癌等消化系統(tǒng)疾病的主要致病因素[1]。流行病學調(diào)查顯示，我國大約有40%～60%的人感染Hp，平均感染率高達54.76%[2]。根除Hp對難治性胃炎的治療和預防胃癌具有重要意義[3-4]。近來隨著Hp耐藥菌株的出現(xiàn)，標準三聯(lián)療法的療效降至＜80%[5]。2004年之前為88.56%，2005至2009年為77.66%，2010年以后進一步下降至71.13%[6]。難治性胃炎患者由于經(jīng)過多次抗Hp治療，常用抗Hp的抗生素耐藥性增加。CYP2C19基因多態(tài)性影響質(zhì)子泵抑制劑（proton pump inhibitors，PPI）藥代動力學和藥效學性質(zhì)，被認為是影響Hp抗生素耐藥性的主要因素之一。已知CYP2C19代謝型有3種不同表型：快代謝（EMs）、中代謝（IMs）和慢代謝（PMs）型[7]。目前對于難治性胃炎患者耐藥率和CYP2C19基因多態(tài)性的研究尚不多。本研究通過檢測難治性胃炎患者Hp感染率、耐藥率、根除率和CYP2C19基因多態(tài)性，探討感染Hp的難治性胃炎患者的根除治療方案，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2015年7月至2017年1月就診于本院消化內(nèi)科的難治性胃炎患者35例。入選標準：臨床診斷結(jié)果為胃炎，Hp根除次數(shù)≥2次，13C尿素酶呼氣試驗陽性。排除標準：患有胃癌或有潰瘍手術(shù)史；近期內(nèi)接受過抗菌藥物治療或檢查前2周內(nèi)服用過抗生素、鉍劑等；妊娠期或哺乳期患者；伴有嚴重肝臟、心血管、腎臟疾病等患者；不宜行胃鏡檢查患者；認知障礙或精神性疾病者。失訪2例，失訪率為5.71%。33例難治性胃炎患者完成全部隨訪，其中男14例，女19例，年齡23～71（54.71±8.80）歲；既往根除治療2次的22例、3次的 8例、4次的3例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過，所有患者知情同意。

1.2 主要儀器及試劑 胃鏡（日本，奧林巴斯CV-290型）、13C尿素呼氣儀及和試劑（德國菲舍爾分析儀器有限公司，HeliFANplus型），NU-4950E二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Nuaire公司），GT9612基因擴增儀（杭州柏恒科技有限公司），甲硝唑（200mg/片，四川科倫制藥有限公司），克拉霉素（250mg/片，浙江京新藥業(yè)有限公司），左氧氟沙星（200mg/片，商品名：來立信，浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠），阿莫西林（500mg/粒，商品名：阿莫靈，中國香港澳美制藥有限公司），枸櫞酸鉍鉀膠囊（300mg/粒，商品名：麗珠得樂，廣東麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司），奧美拉唑（20mg/粒，商品名：金奧康，浙江康恩貝制藥有限公司），血液/組織/細胞基因組提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），2×Taq PCR Master Mix（北京博邁德基因技術(shù)有限公司），哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基（英國Oxoid公司），引物合成（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.113C尿素呼氣試驗（13C-UBT） 所有患者均行13C-UBT檢測。具體操作如下，空腹2h以上的患者向集氣袋中呼氣至飽滿，計為0min呼氣。開水送服13C尿素顆粒后靜坐30min，再次呼氣至氣袋飽滿，計為30min呼氣。計算13CO2呼出率的DOB值，DOB值≥4為陽性。

1.3.2 樣本采集 所有患者均行胃鏡檢查，在胃鏡檢查過程中分別在胃竇小彎側(cè)距幽門5cm、胃竇大彎和胃體各取一塊胃黏膜組織用于Hp分離培養(yǎng)和CYP2C19基因檢測。每塊胃黏膜組織采集后，分別置于3個不同的含腦心浸液的Hp分離培養(yǎng)管中。所有樣本采集后使用干冰運至杭州致遠醫(yī)學檢驗所有限公司進行Hp分離培養(yǎng)、鑒定和藥敏實驗。

1.3.3 Hp分離培養(yǎng) 將胃黏膜組織充分研磨均勻，接種于含5%脫纖維綿羊血的固體培養(yǎng)基上，置于含5%O2、10%CO2和85%N2的37℃三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d?？梢删渫ㄟ^觀察菌體形態(tài)及尿素酶、氧化酶和過氧化氫酶生化反應判定Hp陰/陽性。由于Hp在胃內(nèi)呈灶狀分布，在Hp分離培養(yǎng)過程中，任意一塊胃黏膜組織鑒定為Hp陽性，則該患者判定為Hp陽性。

1.3.4 Hp抗生素耐藥實驗 采用耐藥臨界點瓊脂稀釋法進行抗生素耐藥性檢測。所選抗生素的臨界點為：甲硝唑 8μg/ml，克拉霉素 1μg/ml，左氧氟沙星 2μg/ml。吸取2μl濃度為2.0McF的Hp菌懸液接種于含5%脫纖維綿羊血的固體培養(yǎng)基上，待其干燥后，放置于37℃三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后觀察結(jié)果。實驗過程中選取標準菌株ATCC43504作為對照，每次實驗平行重復2次。

1.3.5 CYP2C19基因型檢測 使用組織基因組提取試劑盒提取胃黏膜組織基因組。以提取的胃黏膜基因組為模板采用PCR擴增CYP2C19*2和CYP2C19*3基因。CYP2C19*2擴增所用引物序列為：5′-GCAGGTATAAGTCTAGGAAATG-3′和 5′-TAAAGTCCCGAGGGTTGTTG-3′；CYP2C19*3 擴增所用引物序列為：5′-CACCCTGTGATCCCACTTTC-3′和 5′-CTAATGGGCTTAGAAGCCTG-3′。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送蘇州金唯智生物科技有限公司進行Sanger測序。使用Chromas軟件分析測序結(jié)果，根據(jù)CYP2C19*2和CYP2C19*3基因的測序結(jié)果將患者歸為：快代謝（636GG，681GG）、中代謝[（636GG，681GA），（636AG，681GG）]和慢代謝[（636GG，681AA），（636AG，681AG），（636AA，681GG）]型。

1.3.6 治療方案及效果判定 采用阿莫西林+任一敏感抗生素+奧美拉唑+枸櫞酸鉍鉀膠囊的14d四聯(lián)療法，CYP2C19快代謝患者奧美拉唑劑量加倍。所有患者均于治療結(jié)束后6周行13C-UBT檢查，結(jié)果陰性者判斷為根除成功，陽性者為根除失敗。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示；計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 難治性胃炎患者Hp分離培養(yǎng)結(jié)果 33例難治性胃炎患者中Hp陽性18例（54.54%），胃竇小彎、胃竇大彎和胃體陽性患者例數(shù)分別為14例（42.42%）、11例（33.33%）和15例（45.45%）。多部位聯(lián)合采樣陽性率與單部位采樣陽性率比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.2 不同CYP2C19基因代謝型患者Hp感染率、耐藥率及根除率比較 見表1。

由表1可見，Hp陽性的18例患者中快代謝患者14例（77.78%），中代謝患者 4例（22.22%），慢代謝患者0例（0%）；對甲硝唑、左氧氟沙星和克拉霉素耐藥分別為17例（94.44%）、8例（44.44%）和5例（27.78%）；治療14d，Hp根除成功17例，失敗1例，根除率為94.44%。不同CYP2C19基因代謝型者Hp感染率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.874，P＜0.05）；Hp 耐藥率、根除率差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

表1 不同CYP2C19代謝型患者Hp感染率、耐藥率及根除率比較[例（%）]

3 討論

Hp在胃內(nèi)往往呈灶狀分布，胃鏡下胃黏膜采樣的準確度直接影響到Hp藥敏試驗的結(jié)果及患者根除率。新悉尼共識建議活檢采樣用于臨床時取2～3塊胃黏膜，胃竇大彎1塊（和胃竇小彎1塊）和胃體小彎1塊[8]。難治性胃炎患者均有抗Hp治療史，長期服用PPI藥物可能會使Hp定植部位發(fā)生遷移。本研究中難治性胃炎患者3個部位胃黏膜Hp的檢出率從大到小依次為胃體＞胃竇小彎＞胃竇大彎，說明難治性胃炎患者經(jīng)幾次失敗的Hp根除治療后，Hp在其胃內(nèi)的定植部位由胃竇向胃體遷移，按照常規(guī)的單部位胃黏膜采樣方式可能會造成假陰性。本研究中3部位聯(lián)合采樣Hp檢出率為54.54%，高于單部位檢出率，與王教常等[9]的研究結(jié)果一致，但由于樣本量小，差異無統(tǒng)計學意義。此外，納入研究的患者均為13C尿素呼氣試驗陽性，而Hp培養(yǎng)結(jié)果陽性率為54.54%，兩者不一致的主要原因有：（1）雖然多部位聯(lián)合取樣明顯提高了Hp的體外檢出率，但考慮到Hp在胃內(nèi)定植的特點和體外培養(yǎng)條件的限制，體外培養(yǎng)仍存在一定比例的假陰性。（2）13C尿素呼氣試驗的原理是根據(jù)Hp含有大量的尿素酶，檢測過程中影響因素少，較Hp體外培養(yǎng)更加靈敏，但是胃內(nèi)胃酸缺乏導致胃內(nèi)非Hp的其他細菌過度生長（如變形桿菌等），也會引起假陽性。（3）Hp僅為螺桿菌屬中的一種，非幽門螺桿的其他螺桿菌，如海爾曼螺桿菌、同性戀螺桿菌、豬螺桿菌等也可引起13C尿素呼氣試驗陽性而Hp體外培養(yǎng)陰性[10]。本研究按照科學研究標準將呼氣和培養(yǎng)雙陽性的患者判定為Hp陽性。

抗生素耐藥是導致Hp根除失敗的主要原因，也是胃炎治療失敗的重要原因。北京的一項流行病學研究顯示，2009至2010年、2013至2014年Hp分離菌株中甲硝唑的耐藥率分別為66.8%和63.4%[11]。然而，本研究中Hp的甲硝唑耐藥率為94.44%，與既往報道的臺州地區(qū)的甲硝唑耐藥率基本一致[12-13]。Hp對克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥率分別為28.78%和44.44%，明顯高于前期研究的數(shù)據(jù)[1，12-14]。這可能與難治性胃炎患者前期治療過程中用藥不規(guī)范和抗生素使用監(jiān)管不力有關(guān)。在對患者3個部位分離出的Hp進行抗生素耐藥實驗過程中，本研究發(fā)現(xiàn)18例陽性患者中有2例患者存在3個不同采樣部位左氧氟沙星耐藥性不一致的現(xiàn)象，說明難治性胃炎患者中存在Hp混合耐藥現(xiàn)象，這也是近年來Hp根除失敗的原因之一。

CYP2C19屬于CYP450家族，是最重要的藥物代謝酶之一。CYP2C19基因突變可影響胃pH值，從而影響克拉霉素、阿莫西林等抗生素的穩(wěn)定性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)難治性胃炎患者的Hp感染率在不同CYP2C19基因代謝型間有統(tǒng)計學差異。含鉍劑的四聯(lián)療法已作為一種有效的補救療法應用到Hp根除失敗的患者中[16]。本研究將CYP2C19快代謝患者的PPI劑量加倍，并結(jié)合藥敏結(jié)果選用阿莫西林+任一敏感抗生素+鉍劑的四聯(lián)治療方案，將難治性胃炎患者的Hp根除率提高至94.44%，在不同CYP2C19基因代謝型間根除率差異顯著。難治性胃炎患者Hp感染率在不同CYP2C19基因代謝型間有統(tǒng)計學差異，經(jīng)過行有針對性的PPI劑量加倍的治療方案后，根除率在不同CYP2C19基因代謝型間無統(tǒng)計學差異，提示CYP2C19基因代謝型在難治性胃炎患者在Hp根除治療過程中具有重要作用，臨床用藥時患者的CYP2C19基因代謝型應當納入考慮指標。

綜上所述，難治性Hp胃炎患者胃黏膜活檢時優(yōu)先選擇多部位聯(lián)合取樣，治療方案應同時基于藥敏試驗結(jié)果和CYP2C19基因代謝型。