何春華 郭紅梅 董來榮 張斌忠 王胤達

利用腫瘤標志物篩選高危患者是提高早期結直腸癌檢出率的重要手段[1]，但現(xiàn)有的腫瘤標志物在靈敏度和特異度方面均未達到理想水平，而新型標志物的篩選仍是當前研究熱點。微小RNA（micro RNA，miRNA）是一類由內源基因編碼、長度約19～25nt的非編碼單鏈RNA分子，具有表達時序性、高度保守性和組織特異性，是當前研究背景下頗具潛力的腫瘤標志物之一。miRNA主要通過與上游長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）、環(huán)狀 RNA（circle RNA，circRNA）以及下游信使RNA（messenger RNA，mRNA）的相互作用調控生物體的生理及病理活動[2-3]。既往研究指出，抑癌基因miR-375可作為結直腸癌臨床診斷與預后評估的重要標志物，并證實Yes相關蛋白（Yes-associated protein 1，YAP1）介導的Hippo信號通路可能是miR-375發(fā)揮腫瘤調控作用的橋梁[4]，由此確立了miR-375-YAP1共表達網絡的存在。本研究進一步尋找miR-375的上游LncRNA，為深入揭示結直腸癌的遺傳機制、尋找新的腫瘤標志物提供參考，現(xiàn)將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年9月至2018年9月在本院接受手術治療的68例結直腸癌患者為結直腸癌組，其中男 39 例，女 29 例；年齡 44～75（62.2±11.0）歲。納入標準：（1）術后病理檢查證實為結直腸癌；（2）留有治療前的體檢血樣；（3）臨床資料完整；（4）隨訪時間≥1年。排除標準：（1）合并內分泌系統(tǒng)疾?。唬?）合并代謝系統(tǒng)疾??；（3）基礎合并癥急性期。選取同期本院體檢的70例健康體檢者為健康對照組，其中男40例，女30例；年齡44～75（61.7±11.3）歲。兩組對象性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。本研究經醫(yī)院倫理委員會審查通過，所有對象簽署知情同意書。

1.2 資料收集 收集結直腸癌患者性別、年齡、腫瘤位置、大小、分化程度、Dukes分期以及術后復發(fā)轉移、死亡情況。以原病灶區(qū)域出現(xiàn)腫瘤病灶為復發(fā)，原病灶區(qū)域以外的地方出現(xiàn)腫瘤病灶為轉移。

1.3 LncRNA SNHG17、miR-375表達水平檢測 采用熒光定量PCR法。收集健康對照者體檢時血樣，結直腸癌患者術前及術后3個月第1次入院復查時血樣；用miRNA快速提取試劑盒提取全血樣本的miRNA，獲得的miRNA以純化柱進行純化，嚴格按照說明書步驟進行操作。所得miRNA樣本常規(guī)反轉錄生成DNA，使用GoTaqqPCR Master Mix試劑盒（promega_CST）生成目的基因，在實時熒光定量PCR擴增儀上進行操作。引物均購自上海生工，具體序列見表1。

表1 LncRNA SNHG17、miR-375引物序列

1.4 LncRNA SNHG17與miR-375相互作用的檢測 采用雙熒光素酶報告實驗。選用293T細胞作為實驗載體，用96孔板培養(yǎng)293T細胞，設3個組：pmir-GLO（空載質粒）組、LncRNA SNHG17-WT（野生型LncRNA SNHG17基因）組、LncRNA SNHG17-MUT組（突變型LncRNA SNHG17基因）組，每組6孔。分別將3組質粒轉染至293T細胞，培養(yǎng)48h。再將各組細胞進一步分成2個亞組，每組3孔。miR-375模擬物（mimics）組加入miR-375 mimics共培養(yǎng)，過表達miR-375；NC mimics組加入NC mimics共培養(yǎng)，作為過表達實驗的陰性對照。更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。使用雙熒光素酶試劑盒進行雙熒光素酶報告實驗，嚴格按照說明書步驟進行操作，最終測定螢火蟲熒光素酶的相對熒光活性。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；組內治療前后比較采用配對樣本t檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。結直腸癌患者LncRNA SNHG17與miR-375表達水平的相關性分析采用Pearson相關；兩者表達水平對結直腸癌患者預后的預測效能采用ROC曲線分析。高、低表達患者的生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用log-rank法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌患者治療前后LncRNA SNHG17、miR-375表達變化及與健康對照者比較 治療前，結直腸癌患者LncRNA SNHG17表達水平高于健康對照者，miR-375表達水平低于健康對照者，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。治療后，結直腸癌患者LncRNA SNHG17表達水平明顯降低，miR-375表達水平明顯升高，與治療前比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 結直腸癌患者治療前后LncRNA SNHG17、miR-375表達變化及與健康對照者比較

2.2 結直腸癌患者LncRNA SNHG17與miR-375表達水平的關系 Pearson相關分析顯示，結直腸癌患者治療前、后LncRNA SNHG17與miR-375表達水平均呈負相關（r=-0.448、-0.603，均 P＜0.05），見圖 1。雙熒光素酶報告實驗證實，結直腸癌患者LncRNA SNHG17與miR-375存在相互作用（P＜0.05），見圖 2。

2.3 不同臨床特征結直腸癌患者術前LncRNA SNHG17、miR-375表達水平比較 不同性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度患者術前LncRNA SNHG17、miR-375表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；不同Dukes分期患者術前LncRNA SNHG17、miR-375表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），其中C期患者LncRNA SNHG17表達水平高于A、B期（均P＜0.05），miR-375表達水平低于A、B期（均 P＜0.05），見表 3。

2.4 術后LncRNA SNHG17及miR-375表達水平對結直腸癌患者預后的預測效能 結直腸癌患者術后隨訪12～24個月，中位時間17個月，無失訪。68例結直腸癌患者出現(xiàn)復發(fā)和轉移11例（16.2%），死亡7例（10.3%）。ROC曲線分析結果顯示，術后LncRNA SNHG17、miR-375表達水平對復發(fā)或轉移、死亡均有預測價值（均P＜0.05），見圖 3。

圖1 結直腸癌患者LncRNA SNHG17與miR-375的Pearson相關分析（a：治療前；b：治療后）

圖2 結直腸癌患者LncRNA SNHG17與miR-375的相互作用（a：兩者結合位點及突變情況；b：雙熒光素酶報告實驗結果，與NC mimics組比較，*P＜0.05）

2.5 術后LncRNA SNHG17及miR-375高、低表達結直腸癌患者生存率比較 根據(jù)ROC曲線分析所得的最佳截斷值為分界線，將結直腸癌患者分為LncRNA SNHG17高表達組22例，低表達組46例；miR-375高表達組25例，低表達組43例。LncRNA SNHG17高表達組生存率低于LncRNA SNHG17低表達組，miR-375高表達組生存率高于miR-375低表達組，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.05），見圖4。

3 討論

構建LncRNA-miRNA-mRNA共表達網絡并定位該基因調控網絡中的關鍵節(jié)點是尋找疾病診治靶點的一項重要手段。由于基因組學信息量大、指標客觀且層次深、具有網絡關聯(lián)性等優(yōu)勢，LncRNA-miRNA-mRNA網絡分析技術在腫瘤病理機制挖掘中取得了長足發(fā)展，被列入癌癥和腫瘤基因圖譜計劃的一部分。LncRNA-miRNA-mRNA共表達網絡運作的基本原理是LncRNA可以作為“分子海綿”阻斷miRNA對下游靶基因轉錄后的抑制作用，使靶基因的功能得以恢復[5]。同樣，miRNA也能反作用于LncRNA，降低其穩(wěn)定性，進而調節(jié)lncRNA的豐度[6]。深入研究調控結直腸癌病理的LncRNA-miRNA-mRNA網絡，對尋找新的診治靶點和挖掘新型標志物具有積極意義。本課題組前期研究證實了miR-375-YAP1共表達網絡的存在[7]，而本研究目的在于進一步尋找miR-375的上游LncRNA，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，具有促癌作用的LncRNA SNHG17與miR-375可能存在相互作用，本研究從臨床方面驗證了結直腸癌中LncRNA SNHG17與miR-375相關，并影響疾病進展。

表3 不同臨床特征結直腸癌患者術前LncRNA SNHG17、miR-375表達水平比較

圖3 術后LncRNA SNHG17及miR-375表達水平預測結直腸癌患者預后的ROC曲線（a：預測復發(fā)或轉移；b：預測死亡）

圖4 術后LncRNA SNHG17及miR-375高、低表達結直腸癌患者的生存曲線（a：LncRNA SNHG17；b：miR-375）

本研究首先分析了LncRNA SNHG17和miR-375在結直腸癌患者循環(huán)系統(tǒng)中的表達特點，發(fā)現(xiàn)治療前結直腸癌患者LncRNA SNHG17表達水平高于健康對照者，miR-375表達水平低于健康對照者；治療后結直腸癌患者LncRNA SNHG17表達水平降低，miR-375表達水平升高；無論治療前還是治療后，LncRNA SNHG17和miR-375表達水平均呈良好的負相關性。在既往研究中，miR-375多被認為是一種抑癌基因，其抑癌效果在多種腫瘤中得到證實[8-10]。研究表明，miR-375能以海綿樣作用吸附多種癌基因，沉默表達，抑制其活性，YAP1便是miR-375的一個重要下游靶點。Zhou等[11]發(fā)現(xiàn)，過表達miR-375可下調YAP1；Dent等[12]證實miR-375能通過YAP1/TEAD4-CTGF軸調節(jié)胃癌細胞株的增殖和遷移能力；本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，YAP1和miR-375的相互作用可能在直腸癌病理中發(fā)揮重要作用。除了YAP1外，miR-375也能作用于其他癌基因，如Song等[13]認為miR-375是p53信號轉導途徑的重要下游分子之一，受到p53基因的直接調控，同時以正反饋方式調節(jié)p53活性，參與p53介導的細胞凋亡過程，進而抑制腫瘤細胞的惡性增殖。進一步研究發(fā)現(xiàn)，3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（3-phosphoinositol dependent protein kinase 1，PDK1）是 miR-375的靶基因，干擾PDK1表達可以提高細胞凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3和Caspase-7的表達，促進腫瘤細胞凋亡[14]。從本研究的初步分析結果來看，LncRNA SNHG17表達趨勢和miR-375表達趨勢相反，且雙熒光素酶報告實驗證實兩者存在共表達情況，這說明LncRNA SNHG17在結直腸癌中可能發(fā)揮促癌作用。進一步分析LncRNA SNHG17、miR-375與結直腸癌臨床特征及預后的關系，發(fā)現(xiàn)術前LncRNA SNHG17和miR-375表達與Dukes分期有關，C期患者LncRNA SNHG17表達高于 A、B期，miR-375表達低于 A、B期。術后LncRNA SNHG17、miR-375表達對結直腸癌復發(fā)轉移和死亡均有較好的預測價值，LncRNA SNHG17表達越高，生存期越短；miR-375表達越高，生存期越長。以上研究結果也支持LncRNA SNHG17可能發(fā)揮促癌作用這一觀點。目前，LncRNA SNHG17在結直腸癌病理中的相關研究尚少。Liu等[15]采用基因芯片技術篩選結腸腺癌發(fā)病早期的差異基因，最終確立了5個有潛在研究價值的 LncRNA， 即 ELFN1-AS1、LINC01234、SNHG17、UCA1、LOC101929549。Ma 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA SNHG17可沉默抑癌基因p57信號的表達，促進結直腸癌細胞的增殖與侵襲。在其他消化系統(tǒng)腫瘤中，尤其是胃癌，也有研究支持LncRNA SNHG17發(fā)揮促癌作用[17-18]，與本研究的推測基本一致。

綜上所述，在結直腸癌發(fā)病進程中，LncRNA SNHG17和miR-375的交互作用可能介導重要機制，實時監(jiān)測兩者對病情診斷和預后評估有幫助。