陳小麗 代小蘭 劉倩菁 李紅霞

線粒體是缺血性損害最主要的亞細(xì)胞靶區(qū)之一[1]，作為細(xì)胞能量合成中心，其功能障礙所致能量耗竭而引發(fā)細(xì)胞凋亡和壞死是缺血性腦損傷最直接的原因[2-3]，因此保護(hù)線粒體或許是延緩缺血性腦損傷的重要途徑。白芍總苷為毛茛科白芍屬植物白芍的活性成分，能夠通過改善血液流變學(xué)指標(biāo)、抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等對缺血性腦損傷起到一定的保護(hù)作用[4-5]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，白芍總苷對缺血性腦損傷大鼠海馬體病理學(xué)改變和海馬神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變具有保護(hù)作用[6]，但其作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)探討白芍總苷是否對缺血性腦損傷大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體（簡稱海馬線粒體）具有保護(hù)作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級 8周齡雄性 SD 大鼠 120只，體質(zhì)量（250±20）g，購自寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK（浙）2014-0005]，動(dòng)物批次號(hào)：20190112004。實(shí)驗(yàn)前清潔環(huán)境采用光照/黑暗周期 1:1，室溫（25±1）℃，相對濕度 60%～70%適應(yīng)性飼養(yǎng)1周；術(shù)前12h禁食，自由飲水。

1.2 藥物與試劑 白芍總苷膠囊購自寧波立華制藥有限公司（國藥準(zhǔn)字 H20055058，規(guī)格：0.3g/粒，含芍藥苷≥104mg，批號(hào)：201804005）；尼莫地平片購自上海信誼天平藥業(yè)股份有限公司（國藥準(zhǔn)字H31022719，規(guī)格：20mg/片，批號(hào)：18062405）。HE試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號(hào)：20180129）；ATP含量以及Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：181107、181030、180812、181005）；水合氯醛購自天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心（批號(hào)：20180325）；鈣標(biāo)準(zhǔn)液購自上海生物制品研究所（批號(hào)：181205）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 缺血性腦損傷大鼠模型的制備[7]將120只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，分別為假手術(shù)組、模型組、白芍總苷 50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg組和尼莫地平1mg/kg組，各20只。缺血性腦損傷模型制備：（1）制作線栓：取直徑0.235mm釣魚線并剪制3.5cm長度分段，輕輕灼燒一側(cè)呈直徑約0.35mm的圓球，于距離“圓球”一側(cè)18～20mm處做標(biāo)記，備用。（2）造模手術(shù)操作：假手術(shù)組除外，其余各組大鼠禁食12h后（自由飲水），腹腔注射10%水合氯醛溶液（3ml/kg）麻醉，頸部正中切口，剝離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，充分暴露3者分叉處，動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈，結(jié)扎并剪斷頸外動(dòng)脈，使用眼科剪在頸外動(dòng)脈殘端上（距離分叉約1cm處）剪出斜形小口、插入線栓進(jìn)頸內(nèi)動(dòng)脈，遇阻力止，深度距分叉處約18mm，固定線栓后松開頸總動(dòng)脈動(dòng)脈夾，逐層縫合，消毒。（3）假手術(shù)組操作：假手術(shù)組大鼠實(shí)施麻醉后，頸部正中切口，剝離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，然后即逐層縫合、消毒。（4）用藥方法：精確稱量白芍總苷內(nèi)容物和尼莫地平，研碎后加入0.9%氯化鈉溶液溶解并稀釋至相應(yīng)濃度。術(shù)后第2天開始，白芍總苷 50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg組及尼莫地平1mg/kg組分別予相應(yīng)溶液5ml/kg灌胃，假手術(shù)組和模型組分別灌胃0.9%氯化鈉溶液5ml/kg，1次/d，共28d。

1.3.2 組織病理學(xué)檢查 第29天，各組按照隨機(jī)數(shù)字表法取6只大鼠，實(shí)施麻醉后開胸暴露心臟，心臟灌注300ml 0.9%氯化鈉溶液，300ml 4%多聚甲醛溶液，灌注速度由快到慢，斷頭取腦置于4%多聚甲醛溶液固定24h；然后進(jìn)行石蠟包埋，應(yīng)用石蠟切片機(jī)（RM2125型，德國Leica公司）2μm厚度切片，經(jīng)二甲苯透明、梯度酒精脫蠟處理后，行HE染色：蘇木精溶液浸泡5min，2次各30s水沖洗，PBS溶液返藍(lán)，30s水洗，伊紅溶液浸泡30s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，倒置光學(xué)顯微鏡（BH-2型，日本Olympus公司）觀察并照相保存。

1.3.3 海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 第31天，各組按照隨機(jī)數(shù)字表法再取6只大鼠，實(shí)施麻醉后開胸暴露心臟，心臟灌注300ml 0.9%氯化鈉溶液后，灌注4%多聚甲醛溶液至肝臟顏色明顯變淡時(shí)，立即斷頭取腦并剝離海馬體，切割成約1mm3小塊后置4℃預(yù)冷的3%戊二醛溶液中于4℃冰箱固定2h，PBS溶液浸洗30min，置于1%四氧化鋨溶液于4℃下固定2h，然后依次經(jīng)梯度酒精脫水、還氧丙烷置換、環(huán)氧樹脂Epon812浸透、包埋、聚合、光學(xué)顯微鏡下定位后，超薄切片（60nm），經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，經(jīng)10 000倍透射電子顯微鏡（H-7650型，日本Hitachi公司）觀察海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.3.4 海馬線粒體腫脹程度、膜流動(dòng)性和線粒體膜總磷脂（簡稱膜總磷脂）含量檢測 （1）海馬線粒體提取及檢測蛋白濃度：第32天，取各組剩余的8只大鼠，麻醉后斷頭并取腦組織，去除腦膜、小腦、嗅球、腦干，用4℃預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后，剝?nèi)∪毖獋?cè)大腦海馬體，參照李富強(qiáng)等[3]報(bào)道的方法制備海馬線粒體：加入適量冷裂解液{0.1mol/L 氨丁三醇（Tris-HCl），調(diào) pH7.4，0.25 mol/L 蔗糖（Sucrose），0.1mol/L乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸[ethylene glycol-bis（2-aminoethylether）-N，N，N′，N′-tetraacetic acid，EGTA]}制備 10%腦組織勻漿液，第1次4℃低溫離心（離心力650g）20min后取上清液，第2次4℃低溫離心（離心力7 700g）20min后取沉淀，即為海馬線粒體。采用Lowry法檢測蛋白濃度。（2）海馬線粒體腫脹程度測定[8]：取海馬線粒體懸液并加入適量蔗糖溶液，4℃低溫離心（離心力7 000g，10min）后去上清液，重復(fù)一次。依次加入1ml蔗糖溶液、1μl CaCl2溶液（濃度200mmol/L）后，通過紫外-可見分光光度計(jì)（UV759型，上海圣科儀器設(shè)備有限公司）檢測520nm波長處吸光度值（A520nm），3min內(nèi)每30s檢測一次，A520nm越小則說明腫脹程度越高。（3）海馬線粒體膜流動(dòng)性測定：第33天，參照Barkhade等[9]的報(bào)道，采用熒光偏振度法測定海馬線粒體膜流動(dòng)性。取1ml海馬線粒體懸液加入3ml濃度為2μmol/L的二苯基己三烯（diphenyl hexatriene，DPH）溶液，25℃恒溫放置 30min后，通過熒光酶標(biāo)儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）測定熒光偏振度P（激發(fā)波長 362nm，發(fā)射波長432nm），P=（I-GI′）/（I+GI′），其中I表示與激發(fā)偏振光振動(dòng)方向平行時(shí)的熒光偏振光強(qiáng)度、I′表示與激發(fā)偏振光振動(dòng)方向垂直時(shí)的熒光偏振光強(qiáng)度，G為校正因子。由P計(jì)算微粘度（η），η=2P（0.46-P），采用 η 值代表線粒體膜流動(dòng)性，η值越小則說明膜流動(dòng)性越大。（4）膜總磷脂含量測定：第33天，采用Trinder酶試劑盒法測定膜總磷脂含量。

1.3.5 海馬線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放度、膜電位檢測 （1）MPTP開放度測定：第34天，取海馬線粒體懸液，遵照MPTP開放度檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）操作說明依步驟處理，操作過程避免光照，通過熒光酶標(biāo)儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）檢測（激發(fā)波長540nm，發(fā)射波長580nm），熒光強(qiáng)度越高表示MPTP開放度越高。（2）膜電位測定：取海馬線粒體懸液，遵照線粒體膜電位水平檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）操作說明依步驟處理，通過熒光酶標(biāo)儀檢測（激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長590nm），線粒體膜電位較高時(shí)產(chǎn)生紅色熒光、較低時(shí)產(chǎn)生綠色熒光。

1.3.6 海馬線粒體呼吸功能和呼吸酶活性檢測 （1）改良Clark氧電極法[10]檢測線粒體呼吸功能：第35天，取1mg蛋白量線粒體懸液，加入2.5ml反應(yīng)介質(zhì)中，30℃恒溫孵育 1min后加入20μl顯色底物，2min后加入10μl濃度為45mmol/L的腺苷二磷酸，連續(xù)描記Ⅲ態(tài)（R3）耗氧曲線和腺苷二磷酸完全磷酸化后的Ⅳ態(tài)（R4）耗氧曲線，R3、R4耗氧速率比值為呼吸控制率（respiratory control rate，RCR），根據(jù)R3耗氧曲線和R4耗氧曲線計(jì)算磷氧比（phosphorus/oxygen，P/O）和氧化磷酸化效率（oxidative phosphorylation rate，OPR）。（2）呼吸酶活性檢測：第35天，取海馬線粒體懸液，經(jīng)3次凍融后，按改進(jìn)氧電極法測定呼吸酶（NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C氧化酶）活性。

1.3.7 海馬線粒體ATP酶活性、ATP含量及游離Ca2+水平檢測 第36天，取海馬線粒體懸液，通過超聲波破碎后，嚴(yán)格按照各檢測試劑盒操作說明步驟檢測Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性，以每小時(shí)每毫克蛋白分解ATP產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為1活力單位[μmol Pi/（mg Pro·h）]。采用比色法檢測海馬線粒體內(nèi)ATP含量。采用原子化學(xué)發(fā)光法，以CaCO3為標(biāo)準(zhǔn)，檢測海馬線粒體內(nèi)游離Ca2+水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較行單因素方差分析，兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠海馬體病理學(xué)改變比較 見圖1。

由圖1可見，白芍總苷50mg/kg組、100mg/kg組海馬體神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，少量細(xì)胞空泡變性，細(xì)胞核偏移、固縮。白芍總苷200mg/kg組和尼莫地平1mg/kg組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞形態(tài)基本正常。模型組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞間隙增大，胞體空泡變性、呈三角形或多角形，細(xì)胞核固縮等。假手術(shù)組海馬神經(jīng)細(xì)胞排列整齊規(guī)則、層次清晰，細(xì)胞呈圓形，結(jié)構(gòu)清楚，核膜、核仁邊界清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)均未見異常。

2.2 6組大鼠海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)改變比較 見圖2。

圖1 6組大鼠海馬體病理學(xué)改變比較（a：白芍總苷50mg/kg組；b：白芍總苷100mg/kg組；c：白芍總苷200mg/kg組；d：尼莫地平1mg/kg 組；e：模型組；f：假手術(shù)組；HE 染色，×400）

圖2 6組大鼠海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)改變比較（a：白芍總苷50mg/kg組；b：白芍總苷100mg/kg組；c：白芍總苷200mg/kg組；d：尼莫地平1mg/kg 組；e：模型組；f：假手術(shù)組；醋酸鈾 - 檸檬酸鉛雙染色，×10 000）

由圖2可見，白芍總苷50mg/kg組海馬線粒體數(shù)量減少，基質(zhì)透明化，膜磷脂層破壞，嵴斷裂溶解、間隙增大。白芍總苷100mg/kg組海馬線粒體數(shù)量減少，膜磷脂層破壞，嵴斷裂溶解。白芍總苷200mg/kg組海馬線粒體數(shù)量基本正常，膜磷脂層和嵴結(jié)構(gòu)基本完整。尼莫地平1mg/kg組海馬線粒體數(shù)量減少，膜磷脂層破壞，嵴斷裂溶解、間隙增大。模型組海馬線粒體數(shù)量減少，基質(zhì)透明化，膜磷脂層破壞，水腫、崩解，嵴斷裂溶解、消失、間隙增大。假手術(shù)組海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)未見明顯異常。

2.3 6組大鼠海馬線粒體A520nm值、η值、膜總磷脂含量比較 見表1。

表1 6組大鼠海馬線粒體A520nm值、η值、膜總磷脂含量比較

由表1可見，6組大鼠間海馬線粒體A520nm值、η值、膜總磷脂含量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬線粒體A520nm值顯著降低、η值顯著升高、膜總磷脂含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與模型組比較，白芍總苷100mg/kg、200mg/kg組和尼莫地平1mg/kg組A520nm值顯著升高、η值顯著降低，白芍總苷100mg/kg、200mg/kg組膜總磷脂含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或 0.01）。

2.4 6組大鼠海馬線粒體MPTP開放度、膜電位比較 見表2。

由表2可見，6組大鼠海馬線粒體MPTP開放度、膜電位比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬線粒體MPTP開放度顯著升高、膜電位顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與模型組比較，白芍總苷100mg/kg、200mg/kg組和尼莫地平1mg/kg組MPTP開放度顯著降低且膜電位顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

表2 6組大鼠海馬線粒體MPTP開放度、膜電位比較

2.5 6組大鼠海馬線粒體呼吸功能和呼吸酶活性比較見表3。

由表3可見，6組大鼠海馬線粒體R3、RCR、P/O、OPR及NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素C氧化酶活性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬線粒體R3、RCR、P/O、OPR顯著降低而R4顯著升高，NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素C氧化酶活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組比較，白芍總苷100mg/kg、200mg/kg組和尼莫地平 1mg/kg 組 R3、RCR、P/O、OPR顯著升高且R4顯著降低，NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素C氧化酶活性顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或 0.01）。

2.6 6組大鼠海馬線粒體ATP酶活性、ATP含量及游離Ca2+水平比較 見表4。

由表4可見，6組大鼠海馬線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性及ATP含量、游離Ca2+水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)海馬線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性和ATP含量均顯著降低，游離Ca2+水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組比較，白芍總苷 100mg/kg、200mg/kg組和尼莫地平1mg/kg組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性和ATP含量顯著升高，游離Ca2+水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

表3 6組大鼠海馬線粒體呼吸功能和呼吸酶活性比較

表4 6組大鼠海馬線粒體ATP酶活性、ATP含量及游離Ca2+水平比較

3 討論

線粒體是細(xì)胞呼吸及能量代謝的中心，在細(xì)胞各種生理過程中均發(fā)揮著重要作用，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)完整是維持其功能的基礎(chǔ)[11]。而線粒體是易受缺血性腦損傷累及的細(xì)胞器之一，本研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦損傷大鼠海馬體呈現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少、間隙增大，胞體空泡變性、呈三角形或多角形，細(xì)胞核固縮等明顯的病理性改變；并且通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，海馬線粒體呈現(xiàn)數(shù)量減少，基質(zhì)透明化，膜磷脂層破壞，水腫、崩解，嵴斷裂溶解、消失、間隙增大等明顯的超微結(jié)構(gòu)病變，該結(jié)果與Jankauskas等[12]的研究結(jié)論一致；此外，缺血性腦損傷將導(dǎo)致海馬線粒體膜腫脹程度升高、膜流動(dòng)性降低、膜磷脂含量降低，與李桂生等[13]研究報(bào)道一致，線粒體為膜性細(xì)胞器，其生理功能依賴膜結(jié)構(gòu)的完整性，而膜腫脹程度、膜流動(dòng)性、膜總磷脂含量能夠反映線粒體膜完整性及其功能。白芍總苷是一種具有多種生物活性的天然化合物，本研究結(jié)果顯示白芍總苷具有抑制缺血性腦損傷大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)病變、抑制海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)病變的作用，緩解海馬線粒體膜水腫并提高膜流動(dòng)性和膜總磷脂含量。

線粒體膜電位是生物膜內(nèi)負(fù)外正而形成的電位差，對維持線粒體功能起著關(guān)鍵作用，其中ATP合成與其密切相關(guān)，Alizadeh等[14]研究發(fā)現(xiàn)膜電位降低將直接導(dǎo)致ATP合成減少并影響正常生命活動(dòng)。MPTP是一種非特異性通道，其開放度受體內(nèi)氧化應(yīng)激水平及Ca2+離子水平調(diào)節(jié)，當(dāng)膜完整性遭到破壞時(shí)MPTP開放度升高，致使正常情況下不能通過的大分子量離子自由通過，破壞離子平衡，此外有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)MPTP開放度升高將導(dǎo)致膜電位下降、釋放促凋亡蛋白而觸發(fā)線粒體凋亡通路[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)白芍總苷治療能夠有效抑制缺血性腦損傷大鼠海馬線粒體膜電位的降低和MPTP開放度的升高。

線粒體的重要生理功能之一是通過呼吸鏈反應(yīng)產(chǎn)生ATP而供給能量，線粒體受損所致能量代謝障礙是缺血性腦損傷發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示缺血性腦損傷大鼠海馬線粒體呼吸功能降低且呼吸酶活性均明顯降低。線粒體呼吸功能降低將直接導(dǎo)致ATP合成受阻并間接影響能量依賴性的ATP酶活性，其中Na+-K+-ATP酶活性降低將導(dǎo)致Na+內(nèi)流，一方面降低膜電位而進(jìn)一步抑制ATP合成，另一方面將引發(fā)Na+/Ca2+交換，使Ca2+進(jìn)入線粒體，正常情況下Ca2+能夠在Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶作用下被泵出而維持線粒體Ca2+平衡，但ATP合成受阻所致Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性降低而使線粒體Ca2+泵出受限而引發(fā)鈣超載[16]，并且鈣超載將抑制線粒體氧化磷酸化功能而抑制ATP合成，從而形成“ATP合成障礙-鈣超載-ATP合成障礙”的“惡性循環(huán)”，最終加重缺血性腦損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)白芍總苷治療能夠明顯改善缺血性腦損傷大鼠海馬線粒體呼吸功能、提高呼吸酶活性和ATP含量，提高海馬線粒體ATP酶活性、降低海馬線粒體Ca2+水平，提示白芍總苷具有保護(hù)缺血性腦損傷大鼠海馬線粒體功能的作用。

綜上所述，白芍總苷具有抑制缺血性腦損傷大鼠海馬線粒體病變并保護(hù)線粒體功能的作用。