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        高效液相色譜法測定鹽酸法舒地爾中間體的含量

        2020-07-06 09:31:16張亞梅王國偉劉璐
        生物化工 2020年3期
        關(guān)鍵詞:舒地爾喹啉精密度

        張亞梅,王國偉,劉璐

        (1.天津天獅學院醫(yī)學院,天津 301700;2.天津柏海藥業(yè)有限責任公司,天津 301700)

        鹽酸法舒地爾注射液是臨床上治療和改善蛛網(wǎng)膜下腔出血使用最多的一種藥。該藥最早在日本上市,由Asahi Kasei株式會社和Nagoya大學共同研制開發(fā)[1]。

        國內(nèi)報道的鹽酸法舒地爾原料的合成思路,都是在日本專利的基礎(chǔ)上,對分離提純和溶劑稍加優(yōu)化,但是合成路線和日本專利基本一致[2-4]。以異喹啉為原料,與發(fā)煙硫酸反應(yīng)得到5-磺酸異喹啉(5-SI),再與SOCl2反應(yīng)得到5-磺酰氯異喹啉鹽酸鹽(5-CQH),再與高哌嗪反應(yīng)得到六氫-1-(5-異喹啉磺?;?-1(H)-1,4-二氮雜卓,最后再鹽酸化、精制,制得目標產(chǎn)物鹽酸法舒地爾。合成路線如圖1所示。

        目前,法舒地爾原料及注射液是國內(nèi)仿制藥申請中非常熱門的品種,已經(jīng)在產(chǎn)和在銷的企業(yè),競爭也是異常激烈[5]。為了提高產(chǎn)品質(zhì)量、安全性和市場競爭力,各企業(yè)都在提升內(nèi)控標準。而提高鹽酸法舒地爾原料的純度,降低雜質(zhì)的種類和含量,對于提高注射劑質(zhì)量和安全性、降低臨床不良反應(yīng)是極其重要的環(huán)節(jié)。研究鹽酸法舒地爾合成過程中原料、各中間體的含量測定方法,以便對每個步驟的產(chǎn)物質(zhì)量進行把關(guān),從而降低終端目標產(chǎn)物的雜質(zhì),提高原料藥質(zhì)量和注射劑質(zhì)量及其安全性。

        圖1 鹽酸法舒地爾合成路線

        異喹啉作為起始原料,文獻有較多報導其含量檢測方法和方法學研究。引用專屬性較強的氣相色譜法[6]測定異喹啉含量對原料進行把關(guān),檢測方便快速。5-磺酸異喹啉是由異喹啉與20%發(fā)煙硫酸進行磺化反應(yīng)而制得。且鹽酸法舒地爾注射液在運輸和儲存過程中,如果保存條件不當,也會降解生成5-SI,給質(zhì)量和安全性帶來很大隱患[7]。目前文獻中及各藥典均未見收載5-SI的含量檢驗方法。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        1200高效液相色譜儀,美國安捷倫公司;XS205DU電子天平,瑞士梅特勒托利多公司;PHS-3C酸度計,上海雷磁儀器有限公司;Milli-Q超純水機,美國密理博公司。

        5-SI對照品,批號DZ1205,含量≥99.9%;三乙胺、甲醇、磷酸均為色譜純,天津康科德科技有限公司;超純水,自制;5-SI樣品3批,市場采購。

        5-CQH對照品,批號DL1301,含量≥99.9%;正己烷、異丙醇均為色譜純,天津科密歐試劑有限公司;超純水,自制;5-CQH樣品3批,市場采購。

        1.2 波長的選擇

        精密稱取5-SI對照品適量,加0.5%三乙胺水溶液(用磷酸調(diào)pH至7.0)-甲醇(60∶40)進行溶解,并稀釋成濃度為 0.06 mg/mL 溶液,在 200~400 nm 區(qū)間內(nèi)進行UV掃描。結(jié)果顯示,5-SI的最大吸收波長為272 nm,故選擇272 nm作為5-SI的檢測波長。

        精密稱取5-CQH對照品適量,加正己烷-異丙醇(90∶10)進行溶解,并稀釋成濃度為0.3 mg/mL的溶液,UV掃描測得最大吸收波長為279 nm,作為檢測波長。

        1.3 色譜條件

        5-SI檢測采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱,流動相0.5%三乙胺水溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.0)-甲醇(60∶ 40),檢測波長 272 nm,流速 0.8 mL/min,柱溫 25 ℃,進樣量 20 μL。

        5-CQH檢測采用多糖涂敷型正相手性柱,流動相正己烷-異丙醇(90∶10)混合液,檢測波長279 nm,流速 1.0 mL/min,柱溫 30 ℃,進樣量 20 μL。

        1.4 溶液的配制

        1.4.1 供試品溶液的配制

        精密稱取5-SI樣品30 mg至100 mL容量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻;精密量取2 mL至10 mL容量瓶中,加流動相稀釋至刻度;搖勻,即得供試品溶液。

        精密稱取5-CQH樣品30 mg至100 mL容量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,即得5-CQH供試品溶液。

        1.4.2 對照品溶液的配制

        精密稱取 5-SI對照品 30 mg 至 100 mL 容量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,得對照品儲備液;精密量取2 mL至10 mL容量瓶中,加流動相稀釋至刻度;搖勻,即得對照品溶液。

        精密稱取5-CQH對照品30 mg至100 mL容量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,即得5-CQH對照品溶液。

        1.5 檢測項目

        對5-SI、5-CQH的檢測進行系統(tǒng)適用性實驗、線性關(guān)系及定量限考察、精密度實驗、回收率實驗、穩(wěn)定性實驗和影響因素實驗。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 5-SI含量測定

        2.1.1 系統(tǒng)適用性實驗

        儀器自動吸取空白流動相、加異喹啉流動相以及對照品溶液各20 μL,按照1.3色譜條件進樣出圖。結(jié)果顯示,空白流動相、加異喹啉流動相均無干擾,對照品出峰時間為3.85 min左右,理論塔板數(shù)為10 488,符合要求。

        2.1.2 線性關(guān)系及定量限考察

        分別取1.4.2項下溶液對照品儲備液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL 到 10 mL 容 量 瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,即得線性對照液1~5號,分別自動進樣 20 μL,得方程:A=157 625C+101.01,線性系數(shù)為 0.999 8。

        結(jié)果顯示該方法在濃度0.015~0.12 mg/mL的范圍內(nèi),峰面積與對照液濃度呈良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9,符合要求。當對3號對照液逐級稀釋,S/N≥3時,測得5-SI的最低檢出限為2.45 ng/mL。

        2.1.3 精密度實驗

        精密度實驗中,取3號溶液重復進樣9次,相對標準偏差(RSD)為0.047%(n=9)。結(jié)果顯示,該方法精密度良好。

        2.1.4 回收率實驗

        5-SI在對照品濃度80%、100%和120%三個濃度的加標回收率在98.06%~101.68%,平均回收率99.76%,相對標準偏差為0.76%,符合要求。

        2.1.5 穩(wěn)定性實驗

        對實際樣品進行了放置 0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h的穩(wěn)定性試驗,測得6份樣品含量的RSD為0.2%,證明5-SI水溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

        2.1.6 影響因素實驗

        對5-SI進行了干擾實驗、高溫破壞、強酸破壞、強堿破壞等條件下的試驗,觀察降解產(chǎn)物的出峰情況。專屬性試驗,空白溶劑與5-SI對主成分峰無干擾。如圖2所示,對樣品進行高溫破壞和強酸破壞,雜峰無增多,主峰峰面積無減小,且主成分峰與其雜質(zhì)峰分離良好;如圖3所示,對樣品進行強堿破壞,在3 min之前的雜質(zhì)峰增多,且雜質(zhì)峰峰面積增大,但主成分峰與其雜質(zhì)峰分離良好,新產(chǎn)生的雜質(zhì)能夠通過此高效液相色譜方法檢測出來。

        2.1.7 樣品含量的測定

        精密稱取3批樣品,按照1.4.1方法配成溶液,測得樣品含量分別為98.7%、98.1%、99.8%,每批RSD均小于0.15%,均符合要求。

        鑒于以上實驗結(jié)果,本方法適用于檢測鹽酸法舒地爾中間體5-SI的含量。

        2.2 5-CQH含量測定

        5-CQH是由5-SI與氯化亞砜進行氯化反應(yīng)而制得。因5-CQH結(jié)構(gòu)的特殊性(遇水極易分解)[5],故選擇正相系統(tǒng)進行方法研究其含量測定方法。

        2.2.1 系統(tǒng)適用性實驗

        按照1.3色譜條件進樣出圖,結(jié)果顯示,空白溶劑對主成分峰無干擾。對照品出峰時間為14.2 min左右,理論塔板數(shù)符合要求。

        2.2.2 線性關(guān)系及定量限考察

        該方法在濃度0.1~0.6 mg/mL范圍內(nèi),峰面積與樣品中目標化合物濃度呈良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r=0.998 9。當S/N≥3時,測得最低檢出限為0.041 μg/mL。

        2.2.3 精密度實驗

        精密度實驗中,取0.3 mg/mL的5-CQH溶液重復進樣9次,RSD為0.5%。證明該方法精密度良好。

        2.2.4 回收率實驗

        5-CQH在對照品濃度的80%、100%和120%三個濃度的加標回收率在98.05%~99.44%,平均回收率98.22%,相對標準偏差為0.9%,符合要求。

        2.2.5 穩(wěn)定性實驗

        采用該方法對實際樣品進行了放置0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h 的穩(wěn)定性試驗,測得 6 份樣品含量的RSD為0.5%,證明5-CQH在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

        2.2.6 影響因素實驗

        因5-CQH遇水分解,本方法是在非水環(huán)境下進行測定,不再進行強酸、強堿實驗。本研究進行了干擾實驗、高溫破壞、光照實驗等,觀察穩(wěn)定性情況。取化合物 5-CQH 3 mg置 100 mL 量瓶中,其溶液呈混懸液,不溶解于異丙醇,進樣前用0.22 μm膜進行過濾,可以除去5-磺酸異喹啉對本方法的干擾。將5-CQH放置在 50 ℃、100 ℃烘箱中分別加熱 5 h,50 ℃檢測含量沒有明顯變化,但是100 ℃加熱以后,已被破壞不再溶于異丙醇。將樣品放置在 1 000~1 500 Lx光照條件下照射8 h,按有關(guān)物質(zhì)色譜條件進行測定。如圖4所示,為5-CQH光照試驗結(jié)果,5-CQH光照后對主成分峰無破壞。

        圖4 5-磺酰氯異喹啉鹽酸鹽光照試驗

        2.2.7 樣品含量的測定

        精密稱取3批樣品,按照1.4.1方法配成溶液,測得樣品含量分別為97.5%、97.1%、97.4%,每批RSD均小于0.23%,均符合要求。

        鑒于以上實驗結(jié)果,本方法適用于檢測鹽酸法舒地爾中間體5-磺酰氯異喹啉鹽酸鹽的含量。

        3 結(jié)果與討論

        (1)本試驗研究了HPLC法測定鹽酸法舒地爾中間體5-SI的含量,通過對線性、定量限、精密度、穩(wěn)定性和回收率等項目的方法學研究,在0.015~0.120 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系(r=0.999 9)良好,回收率99.76%,RSD=0.76%。證明該方法可作5-SI含量測定用。

        (2)本試驗研究了HPLC法測定鹽酸法舒地爾中間體5-CQH的含量,通過對線性、定量限、精密度、穩(wěn)定性、回收率等項目的方法學研究,在0.1~0.6 mg/mL濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系(r=0.999 5)良好,回收率98.22%,RSD=0.90%。證明該方法可作5-CQH含量測定用。

        (3)作為注射劑的原料藥,可以通過過程檢測其含量和雜質(zhì),對終端產(chǎn)品鹽酸法舒地爾的純度起到非常重要的監(jiān)控作用。但是,質(zhì)量源于設(shè)計理念,僅僅靠質(zhì)量標準控制雜質(zhì)難度較大,更多的是基于產(chǎn)品性質(zhì)和過程監(jiān)控體系,所以要把持續(xù)改進和提高監(jiān)控水平貫穿于整個產(chǎn)品生命周期中,才能保證患者用藥的安全性。

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