張亞梅,王國(guó)偉,劉璐
(1.天津天獅學(xué)院醫(yī)學(xué)院,天津 301700;2.天津柏海藥業(yè)有限責(zé)任公司,天津 301700)
鹽酸法舒地爾注射液是臨床上治療和改善蛛網(wǎng)膜下腔出血使用最多的一種藥。該藥最早在日本上市,由Asahi Kasei株式會(huì)社和Nagoya大學(xué)共同研制開發(fā)[1]。
國(guó)內(nèi)報(bào)道的鹽酸法舒地爾原料的合成思路,都是在日本專利的基礎(chǔ)上,對(duì)分離提純和溶劑稍加優(yōu)化,但是合成路線和日本專利基本一致[2-4]。以異喹啉為原料,與發(fā)煙硫酸反應(yīng)得到5-磺酸異喹啉(5-SI),再與SOCl2反應(yīng)得到5-磺酰氯異喹啉鹽酸鹽(5-CQH),再與高哌嗪反應(yīng)得到六氫-1-(5-異喹啉磺?;?-1(H)-1,4-二氮雜卓,最后再鹽酸化、精制,制得目標(biāo)產(chǎn)物鹽酸法舒地爾。合成路線如圖1所示。
目前,法舒地爾原料及注射液是國(guó)內(nèi)仿制藥申請(qǐng)中非常熱門的品種,已經(jīng)在產(chǎn)和在銷的企業(yè),競(jìng)爭(zhēng)也是異常激烈[5]。為了提高產(chǎn)品質(zhì)量、安全性和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力,各企業(yè)都在提升內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。而提高鹽酸法舒地爾原料的純度,降低雜質(zhì)的種類和含量,對(duì)于提高注射劑質(zhì)量和安全性、降低臨床不良反應(yīng)是極其重要的環(huán)節(jié)。研究鹽酸法舒地爾合成過(guò)程中原料、各中間體的含量測(cè)定方法,以便對(duì)每個(gè)步驟的產(chǎn)物質(zhì)量進(jìn)行把關(guān),從而降低終端目標(biāo)產(chǎn)物的雜質(zhì),提高原料藥質(zhì)量和注射劑質(zhì)量及其安全性。
圖1 鹽酸法舒地爾合成路線
異喹啉作為起始原料,文獻(xiàn)有較多報(bào)導(dǎo)其含量檢測(cè)方法和方法學(xué)研究。引用專屬性較強(qiáng)的氣相色譜法[6]測(cè)定異喹啉含量對(duì)原料進(jìn)行把關(guān),檢測(cè)方便快速。5-磺酸異喹啉是由異喹啉與20%發(fā)煙硫酸進(jìn)行磺化反應(yīng)而制得。且鹽酸法舒地爾注射液在運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中,如果保存條件不當(dāng),也會(huì)降解生成5-SI,給質(zhì)量和安全性帶來(lái)很大隱患[7]。目前文獻(xiàn)中及各藥典均未見收載5-SI的含量檢驗(yàn)方法。
1200高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫公司;XS205DU電子天平,瑞士梅特勒托利多公司;PHS-3C酸度計(jì),上海雷磁儀器有限公司;Milli-Q超純水機(jī),美國(guó)密理博公司。
5-SI對(duì)照品,批號(hào)DZ1205,含量≥99.9%;三乙胺、甲醇、磷酸均為色譜純,天津康科德科技有限公司;超純水,自制;5-SI樣品3批,市場(chǎng)采購(gòu)。
5-CQH對(duì)照品,批號(hào)DL1301,含量≥99.9%;正己烷、異丙醇均為色譜純,天津科密歐試劑有限公司;超純水,自制;5-CQH樣品3批,市場(chǎng)采購(gòu)。
精密稱取5-SI對(duì)照品適量,加0.5%三乙胺水溶液(用磷酸調(diào)pH至7.0)-甲醇(60∶40)進(jìn)行溶解,并稀釋成濃度為 0.06 mg/mL 溶液,在 200~400 nm 區(qū)間內(nèi)進(jìn)行UV掃描。結(jié)果顯示,5-SI的最大吸收波長(zhǎng)為272 nm,故選擇272 nm作為5-SI的檢測(cè)波長(zhǎng)。
精密稱取5-CQH對(duì)照品適量,加正己烷-異丙醇(90∶10)進(jìn)行溶解,并稀釋成濃度為0.3 mg/mL的溶液,UV掃描測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為279 nm,作為檢測(cè)波長(zhǎng)。
5-SI檢測(cè)采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱,流動(dòng)相0.5%三乙胺水溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.0)-甲醇(60∶ 40),檢測(cè)波長(zhǎng) 272 nm,流速 0.8 mL/min,柱溫 25 ℃,進(jìn)樣量 20 μL。
5-CQH檢測(cè)采用多糖涂敷型正相手性柱,流動(dòng)相正己烷-異丙醇(90∶10)混合液,檢測(cè)波長(zhǎng)279 nm,流速 1.0 mL/min,柱溫 30 ℃,進(jìn)樣量 20 μL。
1.4.1 供試品溶液的配制
精密稱取5-SI樣品30 mg至100 mL容量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻;精密量取2 mL至10 mL容量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度;搖勻,即得供試品溶液。
精密稱取5-CQH樣品30 mg至100 mL容量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,即得5-CQH供試品溶液。
1.4.2 對(duì)照品溶液的配制
精密稱取 5-SI對(duì)照品 30 mg 至 100 mL 容量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,得對(duì)照品儲(chǔ)備液;精密量取2 mL至10 mL容量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度;搖勻,即得對(duì)照品溶液。
精密稱取5-CQH對(duì)照品30 mg至100 mL容量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,即得5-CQH對(duì)照品溶液。
對(duì)5-SI、5-CQH的檢測(cè)進(jìn)行系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)、線性關(guān)系及定量限考察、精密度實(shí)驗(yàn)、回收率實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和影響因素實(shí)驗(yàn)。
2.1.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)
儀器自動(dòng)吸取空白流動(dòng)相、加異喹啉流動(dòng)相以及對(duì)照品溶液各20 μL,按照1.3色譜條件進(jìn)樣出圖。結(jié)果顯示,空白流動(dòng)相、加異喹啉流動(dòng)相均無(wú)干擾,對(duì)照品出峰時(shí)間為3.85 min左右,理論塔板數(shù)為10 488,符合要求。
2.1.2 線性關(guān)系及定量限考察
分別取1.4.2項(xiàng)下溶液對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL 到 10 mL 容 量 瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,即得線性對(duì)照液1~5號(hào),分別自動(dòng)進(jìn)樣 20 μL,得方程:A=157 625C+101.01,線性系數(shù)為 0.999 8。
結(jié)果顯示該方法在濃度0.015~0.12 mg/mL的范圍內(nèi),峰面積與對(duì)照液濃度呈良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9,符合要求。當(dāng)對(duì)3號(hào)對(duì)照液逐級(jí)稀釋,S/N≥3時(shí),測(cè)得5-SI的最低檢出限為2.45 ng/mL。
2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn)
精密度實(shí)驗(yàn)中,取3號(hào)溶液重復(fù)進(jìn)樣9次,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.047%(n=9)。結(jié)果顯示,該方法精密度良好。
2.1.4 回收率實(shí)驗(yàn)
5-SI在對(duì)照品濃度80%、100%和120%三個(gè)濃度的加標(biāo)回收率在98.06%~101.68%,平均回收率99.76%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.76%,符合要求。
2.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行了放置 0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h的穩(wěn)定性試驗(yàn),測(cè)得6份樣品含量的RSD為0.2%,證明5-SI水溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.1.6 影響因素實(shí)驗(yàn)
對(duì)5-SI進(jìn)行了干擾實(shí)驗(yàn)、高溫破壞、強(qiáng)酸破壞、強(qiáng)堿破壞等條件下的試驗(yàn),觀察降解產(chǎn)物的出峰情況。專屬性試驗(yàn),空白溶劑與5-SI對(duì)主成分峰無(wú)干擾。如圖2所示,對(duì)樣品進(jìn)行高溫破壞和強(qiáng)酸破壞,雜峰無(wú)增多,主峰峰面積無(wú)減小,且主成分峰與其雜質(zhì)峰分離良好;如圖3所示,對(duì)樣品進(jìn)行強(qiáng)堿破壞,在3 min之前的雜質(zhì)峰增多,且雜質(zhì)峰峰面積增大,但主成分峰與其雜質(zhì)峰分離良好,新產(chǎn)生的雜質(zhì)能夠通過(guò)此高效液相色譜方法檢測(cè)出來(lái)。
2.1.7 樣品含量的測(cè)定
精密稱取3批樣品,按照1.4.1方法配成溶液,測(cè)得樣品含量分別為98.7%、98.1%、99.8%,每批RSD均小于0.15%,均符合要求。
鑒于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本方法適用于檢測(cè)鹽酸法舒地爾中間體5-SI的含量。
5-CQH是由5-SI與氯化亞砜進(jìn)行氯化反應(yīng)而制得。因5-CQH結(jié)構(gòu)的特殊性(遇水極易分解)[5],故選擇正相系統(tǒng)進(jìn)行方法研究其含量測(cè)定方法。
2.2.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)
按照1.3色譜條件進(jìn)樣出圖,結(jié)果顯示,空白溶劑對(duì)主成分峰無(wú)干擾。對(duì)照品出峰時(shí)間為14.2 min左右,理論塔板數(shù)符合要求。
2.2.2 線性關(guān)系及定量限考察
該方法在濃度0.1~0.6 mg/mL范圍內(nèi),峰面積與樣品中目標(biāo)化合物濃度呈良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r=0.998 9。當(dāng)S/N≥3時(shí),測(cè)得最低檢出限為0.041 μg/mL。
2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn)
精密度實(shí)驗(yàn)中,取0.3 mg/mL的5-CQH溶液重復(fù)進(jìn)樣9次,RSD為0.5%。證明該方法精密度良好。
2.2.4 回收率實(shí)驗(yàn)
5-CQH在對(duì)照品濃度的80%、100%和120%三個(gè)濃度的加標(biāo)回收率在98.05%~99.44%,平均回收率98.22%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%,符合要求。
2.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
采用該方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行了放置0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h 的穩(wěn)定性試驗(yàn),測(cè)得 6 份樣品含量的RSD為0.5%,證明5-CQH在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.2.6 影響因素實(shí)驗(yàn)
因5-CQH遇水分解,本方法是在非水環(huán)境下進(jìn)行測(cè)定,不再進(jìn)行強(qiáng)酸、強(qiáng)堿實(shí)驗(yàn)。本研究進(jìn)行了干擾實(shí)驗(yàn)、高溫破壞、光照實(shí)驗(yàn)等,觀察穩(wěn)定性情況。取化合物 5-CQH 3 mg置 100 mL 量瓶中,其溶液呈混懸液,不溶解于異丙醇,進(jìn)樣前用0.22 μm膜進(jìn)行過(guò)濾,可以除去5-磺酸異喹啉對(duì)本方法的干擾。將5-CQH放置在 50 ℃、100 ℃烘箱中分別加熱 5 h,50 ℃檢測(cè)含量沒(méi)有明顯變化,但是100 ℃加熱以后,已被破壞不再溶于異丙醇。將樣品放置在 1 000~1 500 Lx光照條件下照射8 h,按有關(guān)物質(zhì)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。如圖4所示,為5-CQH光照試驗(yàn)結(jié)果,5-CQH光照后對(duì)主成分峰無(wú)破壞。
圖4 5-磺酰氯異喹啉鹽酸鹽光照試驗(yàn)
2.2.7 樣品含量的測(cè)定
精密稱取3批樣品,按照1.4.1方法配成溶液,測(cè)得樣品含量分別為97.5%、97.1%、97.4%,每批RSD均小于0.23%,均符合要求。
鑒于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本方法適用于檢測(cè)鹽酸法舒地爾中間體5-磺酰氯異喹啉鹽酸鹽的含量。
(1)本試驗(yàn)研究了HPLC法測(cè)定鹽酸法舒地爾中間體5-SI的含量,通過(guò)對(duì)線性、定量限、精密度、穩(wěn)定性和回收率等項(xiàng)目的方法學(xué)研究,在0.015~0.120 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系(r=0.999 9)良好,回收率99.76%,RSD=0.76%。證明該方法可作5-SI含量測(cè)定用。
(2)本試驗(yàn)研究了HPLC法測(cè)定鹽酸法舒地爾中間體5-CQH的含量,通過(guò)對(duì)線性、定量限、精密度、穩(wěn)定性、回收率等項(xiàng)目的方法學(xué)研究,在0.1~0.6 mg/mL濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系(r=0.999 5)良好,回收率98.22%,RSD=0.90%。證明該方法可作5-CQH含量測(cè)定用。
(3)作為注射劑的原料藥,可以通過(guò)過(guò)程檢測(cè)其含量和雜質(zhì),對(duì)終端產(chǎn)品鹽酸法舒地爾的純度起到非常重要的監(jiān)控作用。但是,質(zhì)量源于設(shè)計(jì)理念,僅僅靠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制雜質(zhì)難度較大,更多的是基于產(chǎn)品性質(zhì)和過(guò)程監(jiān)控體系,所以要把持續(xù)改進(jìn)和提高監(jiān)控水平貫穿于整個(gè)產(chǎn)品生命周期中,才能保證患者用藥的安全性。