翟 羽，董科明，郭紅延，劉 翠，徐紅梅，申葉春，李金儒，梅 穩(wěn)

干細(xì)胞是組織工程的種子細(xì)胞，在體外具有分化成包括成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞在內(nèi)等多種細(xì)胞的潛能。干細(xì)胞的分化方向是由它所處的微環(huán)境所決定的[1]。BMSCs是一種組織工程中常用的種子細(xì)胞，有多條信號(hào)通路調(diào)控BMSCs的分化[2,3]，其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用尤為重要。激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可促進(jìn)BMSCs成骨分化并抑制其成脂分化[4]。BMSCs的成脂分化又受到多種轉(zhuǎn)錄因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，其中比較重要的轉(zhuǎn)錄因子包括氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPARγ)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein α, C/EBPα)等[5]，而PPARγ和C/EBPα又均受到Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控[6]。鳶尾素是新近發(fā)現(xiàn)的一種由運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的肌源性細(xì)胞因子，在棕色脂肪組織中高表達(dá)[7]。最近有研究報(bào)道，鳶尾素可促進(jìn)BMSCs成骨分化[8-10]，且可抑制脂肪組織的分化、成熟[11]。但是，鳶尾素對(duì)BMSCs成脂分化的影響及其作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬以體外培養(yǎng)的兔BMSCs為研究對(duì)象，觀察鳶尾素對(duì)BMSCs脂向分化的影響并探討其信號(hào)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器 3個(gè)月齡雌性新西蘭大白兔1只，購自軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。重組人鳶尾素(美國Phoenix Pharmaceuticals公司)；α-MEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國amresco公司)；消炎痛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、普通牛胰島素、地塞米松、L-谷氨酰胺、二甲基亞砜(DMSO, 美國Sigma公司)；油紅O、異丙醇(上海國藥集團(tuán))；Trizol(美國Invitrogen公司)；Wnt10a抗體(貨號(hào)：(#sc-376028; 美國Santa Cruz公司)；BCA測(cè)定試劑盒(南京建成)；PVDF膜(美國Millipore公司)。

Herocell C1型CO2恒溫培養(yǎng)箱(中國潤度生物)；BCM-1000A型生物凈化工作臺(tái)(蘇州安泰)；5702R型低速離心機(jī)、Biophotometer核酸蛋白測(cè)定儀(德國eppendorf公司)；Multiskan型酶聯(lián)儀(美國賽默飛·世爾公司)；DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型轉(zhuǎn)膜儀(六一儀器廠)；LW300LFT型正置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 取第2代兔BMSCs接種于96孔板，并將細(xì)胞分成2組：對(duì)照組僅采用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；鳶尾素組則在α-MEM培養(yǎng)液中加入100 ng/ml的重組鳶尾素，劑量參考既往報(bào)道[8,11]。接種后1～11 d，每天采用MTT法檢測(cè)BMSCs的增殖活性，檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[12]。

1.3 qPCR檢測(cè)成脂相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá) 將第3代BMSCs以1.0×104/孔的密度接種于24孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底面積70%時(shí)，換為自行配制的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液(在高糖DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、1000 nmol/L地塞米松、10 mg/L 牛胰島素、60 μmol/L消炎痛和0.5 mmol/L IBMX)培養(yǎng)，同時(shí)加入0 ng/ml(對(duì)照組)或者100 ng/ml的鳶尾素(鳶尾素組)。 兩組細(xì)胞分別成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14 d后提取總RNA，再將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增。然后，檢測(cè)PPARγ和C/EBPα等成脂相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，96 ℃變30 s，58 ℃退火30 s，73 ℃延伸45 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后73 ℃ 延伸10 min?；蛞镉缮虾Ｉ旯ど锖铣?，序列見表1。

表1 成脂相關(guān)基因引物序列

注：GAPDH為內(nèi)參

1.4 油紅O染色及定量分析 對(duì)照組和鳶尾素組BMSCs在成脂誘導(dǎo)14 d后，倒掉誘導(dǎo)液，PBS緩沖液漂洗干凈，10%中性甲醛固定30 min，然后進(jìn)行油紅O染色并于顯微鏡下拍照。最后，用異丙醇振蕩洗脫至油紅O脂滴全部脫落，并于490 nm處測(cè)定吸光度值。

1.5 Western blot檢測(cè)Wnt10a的表達(dá) 對(duì)照組和鳶尾素組BMSCs在成脂誘導(dǎo)7 d后，依據(jù)Western blot實(shí)驗(yàn)的常規(guī)步驟[13]裂解細(xì)胞并提取總蛋白，凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、顯影后，采用Image J軟件分析膠片灰度。

2 結(jié) 果

2.1 鳶尾素對(duì)BMSCs增殖活性的影響 BMSCs的增殖曲線呈S形，細(xì)胞在前5 d增殖緩慢，第6～7天增殖最快，此后細(xì)胞生長(zhǎng)處于平臺(tái)期。而鳶尾素對(duì)BMSCs增殖無明顯影響(圖1)，表明鳶尾素?zé)o細(xì)胞毒性。

2.2 鳶尾素對(duì)BMSCs成脂相關(guān)基因表達(dá)水平的影響 qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示：在BMSCs成脂分化的第7天，與對(duì)照組相比，鳶尾素明顯抑制成脂相關(guān)基因PPARγ[(0.20±0.06)vs(1.00±0.10)]和C/EBPα[(0.40±0.06)vs(1.00±0.12)]的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(P<0.05)；甚至在BMSCs成脂分化的第14天，鳶尾素仍能顯著抑制PPARγ[(0.61±0.06)vs(1.00±0.15)]和C/EBPα[(0.70±0.09)vs(1.00±0.18)]的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(P<0.05)。

圖1 BMSCs增殖曲線

2.3 鳶尾素對(duì)BMSCs成脂分化的影響 對(duì)各組BMSCs成脂誘導(dǎo)14 d后行油紅O染色，對(duì)照組細(xì)胞中可見大小混合型的脂滴布滿整個(gè)視野，而鳶尾素組細(xì)胞中脂質(zhì)沉積明顯減少。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞中的油紅O進(jìn)行半定量分析，結(jié)果也證實(shí)鳶尾素組油紅O的OD值顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.45±0.05)vs(0.95±0.10)；P<0.05]。

2.4 鳶尾素對(duì)Wnt10a蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示：在BMSCs脂向分化的過程中，鳶尾素能顯著提高Wnt10a蛋白的表達(dá)水平，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(5.01±0.78)vs(1.00±0.25)；P<0.05]。

3 討 論

本研究以兔BMSCs為細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)在BMSCs成脂分化的過程中，鳶尾素能顯著提高Wnt10a信號(hào)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)成脂相關(guān)基因PPARγ和C/EBPα的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并最終抑制BMSCs成脂分化。

運(yùn)動(dòng)是預(yù)防肥胖和代謝性疾病的有效策略，不僅僅是因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)能直接增強(qiáng)骨骼肌的強(qiáng)度，而且運(yùn)動(dòng)能誘導(dǎo)骨骼肌產(chǎn)生肌源性細(xì)胞因子，例如鳶尾素、白細(xì)胞介素-15和成纖維細(xì)胞因子21等[14]。這些細(xì)胞因子通過內(nèi)分泌或旁分泌等方式調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝，對(duì)機(jī)體器官的代謝紊亂起到間接的保護(hù)作用。因此，肌源性細(xì)胞因子是聯(lián)系骨骼肌和機(jī)體其它系統(tǒng)的重要紐帶[15]。鳶尾素是運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)骨骼肌產(chǎn)生的一種非常重要得細(xì)胞因子，它依賴激活PGC1α起作用[16]。分泌型鳶尾素的主要功能是通過上調(diào)解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)的表達(dá)，促進(jìn)白色脂肪棕色化[7]，進(jìn)而通過增加能量代謝來緩解代謝性疾病[17]。例如，有研究表明，鳶尾素能通過減少脂肪酸合酶的生成抑制人脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的沉積[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，鳶尾素能抑制BMSCs成脂分化。這間接地佐證了干細(xì)胞分化平衡理論，即促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化就會(huì)抑制干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，因?yàn)轼S尾素能促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化已被廣泛證實(shí)[8-10]。與本研究相似，有實(shí)驗(yàn)表明，鳶尾素也能抑制成熟的脂肪細(xì)胞分化[19]。

經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路是調(diào)控成骨與成脂的重要信號(hào)通路[20]。有研究報(bào)道稱，鳶尾素可以通過下調(diào)sclerotin(一種Wnt/β-catenin信號(hào)通路的特異性抑制劑)來促進(jìn)骨生成與礦化[21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在抑制BMSCs成脂分化的過程中，鳶尾素能促進(jìn)Wnt10a的合成。當(dāng)然，在經(jīng)典Wnt信號(hào)通路還存在其它配體，如Wnt10b和Wnt6等，未檢測(cè)鳶尾素對(duì)其它配體表達(dá)的影響是本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)局限性。Wnt信號(hào)通路調(diào)控成脂關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ，C/EBPα和脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4, FABP4)的表達(dá)，PPARγ和C/EBPα主要調(diào)控成脂早期的細(xì)胞分化，而FABP4主要調(diào)控成脂末期的細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無論在成脂早期(7 d)還是終末期(14 d)，鳶尾素都能顯著抑制PPARγ和C/EBPα的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。新近有研究表明[11]，無論是內(nèi)源性還是外源性的鳶尾素均能抑制脂肪組織的成熟、分化，并且鳶尾素的抑制作用與激活Wnt信號(hào)通路相關(guān)，這與本研究的結(jié)果一致。

鳶尾素是纖維連結(jié)蛋白Ⅲ型域包含蛋白5(type III domain-containing protein 5, FNDC5)的分泌形式，F(xiàn)NDC5體內(nèi)超表達(dá)可以顯著升高循環(huán)中鳶尾素的水平[22]，而直接在BMSCs中超表達(dá)FNDC5能否抑制其自身成脂分化值得進(jìn)一步探討。本研究未進(jìn)行劑量-反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，因此并不清楚其它干預(yù)劑量的鳶尾素對(duì)BMSCs成脂分化的影響，后續(xù)研究應(yīng)設(shè)計(jì)多個(gè)干預(yù)劑量。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)鳶尾素能夠在體外抑制兔BMSCs脂向分化，并且鳶尾素的這種作用與激活Wnt信號(hào)通路有關(guān)。鳶尾素有望被開發(fā)成抑制BMSCs脂向分化，進(jìn)而促進(jìn)BMSCs成骨分化的一種新型藥物。