李川皓，劉艷艷，金娉婷，趙紅波，李會(huì)榮，王星凌，盛清凱

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100；3.山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東 濟(jì)南 253600）

目前國(guó)家大力實(shí)施糧改飼戰(zhàn)略。糧改飼，以全株青貯玉米為重點(diǎn)。玉米，我國(guó)種植面積最大，為主要糧飼作物。過(guò)去常用青貯池或青貯窖將蠟熟期或完熟期的全株玉米青貯后飼喂牛羊，目前也用塑料袋或噸包將乳熟期的全株青綠玉米厭氧發(fā)酵后飼喂生豬［1］。全株青綠玉米塑料袋發(fā)酵與蠟熟期、完熟期全株玉米青貯池青貯存在異同。差異之處在于：前者全株玉米一般乳熟期收割，粉碎至0.2～0.5 cm小段，添加外源菌，厭氧發(fā)酵7 d后飼喂生豬；后者全株玉米一般蠟熟期或完熟期收割，粉碎至1～3 cm小段，發(fā)酵2個(gè)月后飼喂牛羊。相同之處在于：二者全株玉米皆易與氧氣接觸霉變。塑料袋發(fā)酵霉變的全株玉米常含有白色斑塊或菌絲，其霉變的菌種屬性未見報(bào)道，霉變機(jī)理也不清楚。塑料袋發(fā)酵全株玉米時(shí)，常常添加外源乳酸菌、枯草芽孢桿菌等［1］，用以提高營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及達(dá)到保鮮、長(zhǎng)期貯存的目的，但外源菌對(duì)其霉變的影響尚不清楚。霉變不但降低青貯玉米的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，還容易導(dǎo)致家畜疾病的發(fā)生［2］。青貯玉米霉變真菌主要為酵母［3］及霉菌［4］。本試驗(yàn)旨在確定塑料袋發(fā)酵全株青綠玉米中霉變真菌的菌種屬性，研究外源菌對(duì)霉變?nèi)昵嗑G玉米中菌、酶等指標(biāo)的影響，探討霉變及影響機(jī)理，為糧改飼提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

乳熟期的全株青綠玉米，臨邑綠葉種豬場(chǎng)提供。枯草芽孢桿菌和乳酸菌，其含量分別為1×109cfu/g和1×107cfu/g，皆由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供。TIANGEN真菌提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)。丙二醛、羥自由基、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、總抗氧化能力、檸檬酸合成酶、乳酸脫氫酶、NADH氧化酶試劑盒，皆由南京建成生物工程公司生產(chǎn)。微生物培養(yǎng)基，由北京陸橋技術(shù)股份公司生產(chǎn)。麩皮等，市場(chǎng)購(gòu)買。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年9月進(jìn)行。采用2×2析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)。將剛收割的乳熟期全株青綠玉米粉碎至0.2～0.4 cm，然后與30%的麩皮混合。將混合物隨機(jī)均分為對(duì)照組（CG）和試驗(yàn)組（TG）。對(duì)照組不添加外源菌，試驗(yàn)組添加外源菌，外源菌添加量為0.1‰。外源菌為枯草芽孢桿菌和乳酸菌的混合菌，其含量分別為1×109cfu/g和1×107cfu/g。將對(duì)照組及試驗(yàn)組各自均分10份，分別裝入塑料袋中在同等條件下厭氧發(fā)酵。每組10袋，每袋高0.8 m、直徑0.6 m、重約70 kg。厭氧發(fā)酵0、7、15、45 d分別開袋，每次開袋5 min，開袋后重新排氣扎口。試驗(yàn)中，發(fā)酵第45 d，各組外觀皆無(wú)霉斑出現(xiàn)。

厭氧發(fā)酵第90 d袋口及塑料袋側(cè)壁出現(xiàn)霉斑。塑料袋扎口處霉斑最大，為整個(gè)霉斑，成白色，直徑約為10 cm。塑料袋側(cè)壁多處出現(xiàn)霉斑，白色，霉斑直徑約為2 cm。當(dāng)天剪開塑料袋快速剝離對(duì)照組和試驗(yàn)組直徑為2 cm左右的霉斑，分別記為對(duì)照組霉斑樣品（CG-M）和試驗(yàn)組霉斑樣品（TG-M），并液氮保存帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行真菌多樣性分析。以霉斑圓點(diǎn)為核心，選取周邊距圓點(diǎn)7 cm處有代表性位點(diǎn)三處，取對(duì)照組和試驗(yàn)組無(wú)霉斑樣品100 g，分別為對(duì)照組無(wú)霉斑樣品（CG-NM）和試驗(yàn)組無(wú)霉斑樣品（TG-NM），液氮保存帶回試驗(yàn)室進(jìn)行分析。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 霉斑真菌18SrDNA基因全序列的克隆和分析 使用真菌提取試劑盒進(jìn)行DNA抽提。以nu-ssu-0817、NS8為擴(kuò)增引物，擴(kuò)增真菌18S rDNA基因部分序列1 000 bp左右。PCR反應(yīng)體系（50μL）：DNA 2μL，EX Taq 0.25μL，10×Buffer 5μL和2μL的nu-ssu-0817（10μmol/L）、2μL的NS8（10μmol/L），加水至50μL。PCR程序：95℃預(yù)變性3 min，32次PCR循環(huán)（95℃變性45 s，55℃變性45 s，72℃變性90 s），最后72℃延伸10 min，10℃保存。將回收后的2μg PCR產(chǎn)物與PMD18-T載體16℃過(guò)夜連接，10μL連接產(chǎn)物全部加入至100μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30 min；42℃熱激45 s后，放置冰上1 min，加入890μL AMP陰性培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60 min，取100μL鋪板。構(gòu)建3個(gè)18S rDNA克隆庫(kù)。從每個(gè)樣品克隆庫(kù)中挑選100個(gè)克隆子PCR擴(kuò)增跑瓊脂糖凝膠進(jìn)行克隆子篩選，對(duì)篩選出的克隆子進(jìn)行測(cè)序（正反兩個(gè)方向）、序列組裝、拼接，得到完整18S rDNA序列，然后在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST分析鑒定真菌菌種的屬性。

1.3.2 菌、酶及自由基等指標(biāo)檢測(cè) 檢測(cè)時(shí)將樣品與水按重量比1∶9混合，浸泡30 min后3 000 r/min離心，取上清液進(jìn)行菌、酶等指標(biāo)檢測(cè)。乳酸菌、酵母、霉菌，采用平板計(jì)數(shù)法，乳酸菌為MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，霉菌及酵母采用CM123馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)。丙二醛、羥自由基、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、總抗氧化能力、檸檬酸合成酶、乳酸脫氫酶、NADH氧化酶，按試劑盒要求檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SAS v9.2軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。采用TWO-WAY ANOVA進(jìn)行方差分析，采用Student-Newmnan-Keuls法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉變?nèi)昵嗑G玉米真菌屬性與多樣性分析

從分析結(jié)果（表1）看出，霉變?nèi)昵嗑G玉米的真菌為假絲酵母、煙紅曲霉和釀酒酵母。

表1 霉變玉米的真菌屬性

由圖1看出，CG-NM組與TG-NM組相比，CG-M組與TG-M組相比，加菌組中真菌種類皆減少釀酒酵母。CG-NM組與CG-M組相比，TG-NM與TG-M組相比，霉變組中的真菌皆增加煙紅曲霉。

圖1 霉變?nèi)暧衩渍婢鄻有苑治?/p>

2.2 添加外源菌對(duì)霉變?nèi)昵嗑G玉米菌群的影響

由表2看出，對(duì)于乳酸菌而言，霉變效應(yīng)、加菌效應(yīng)及二者的互作效應(yīng)皆顯著（P＜0.05）。霉變及加菌皆降低乳酸菌的含量，四組樣品中TGNM乳酸菌含量最高，TG-M 乳酸菌含量最低。對(duì)于酵母，霉變效應(yīng)、加菌效應(yīng)及二者的互作效應(yīng)也皆顯著（P＜0.05）。霉變及加菌皆升高酵母的含量，四組樣品中TG-M 酵母含量最高，CGNM酵母含量最低。對(duì)于pH，霉變效應(yīng)及加菌效應(yīng)皆顯著（P＜0.05），但二者互作效應(yīng)不顯著（P＞0.05），霉變極顯著升高pH（P＜0.01），而加菌相反（P＜0.05）。

表2 外源菌對(duì)霉變?nèi)昵嗑G玉米菌群及pH值的影響

2.3 添加外源菌對(duì)全株青綠玉米自由基及清除劑的影響

由表3看出，對(duì)于羥自由基而言，霉變效應(yīng)顯著（P＜0.05），而加菌效應(yīng)及二者互作皆不顯著（P＞0.05），霉變提高羥自由基含量。對(duì)于丙二醛，霉變效應(yīng)、加菌效應(yīng)顯著，二者皆升高丙二醛含量（P＜0.05）。對(duì)于過(guò)氧化氫酶，盡管霉變和加菌皆升高過(guò)氧化氫酶含量，但霉變及加菌效應(yīng)皆不顯著（P＞0.05）。對(duì)于過(guò)氧化物酶，霉變效應(yīng)及加菌效應(yīng)皆極顯著（P＜0.01），霉變?cè)鰪?qiáng)該酶活性，而加菌相反（P＜0.01）。

表3 外源菌對(duì)霉變?nèi)昵嗑G玉米自由基及清除劑的影響

2.4 外源菌對(duì)全株青綠玉米總抗氧化能力及酶活的影響

由表4看出，對(duì)于總抗氧化能力而言，霉變及加菌皆顯著降低全株玉米的總抗氧化能力（P＜0.05），二者無(wú)互作（P＞0.05）。霉變及加菌對(duì)于檸檬酸合成酶皆無(wú)影響（P＞0.05）。對(duì)于乳酸脫氫酶，霉變及加菌皆降低該酶活性（P＜0.05）。對(duì)于NADH 氧化酶，霉變升高該酶活性（P＜0.01），而加菌對(duì)該酶活性無(wú)影響（P＞0.05）。

表4 外源菌對(duì)霉變?nèi)昵嗑G玉米抗氧化能力及酶活的影響

3 討論與結(jié)論

關(guān)于塑料袋發(fā)酵霉變玉米的真菌研究未見報(bào)道。目前普遍認(rèn)為酵母［3］、霉菌［4］等真菌及好氧菌導(dǎo)致了青貯全株玉米霉變。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)塑料袋發(fā)酵霉變?nèi)暧衩椎恼婢鸀榻湍负兔咕@和全株玉米青貯霉變真菌相似，差異之處在于酵母、霉菌類型不同。本試驗(yàn)中塑料袋發(fā)酵玉米真菌為假絲酵母、釀酒酵母和煙紅曲霉，而青貯霉變真菌為假絲酵母、漢遜酵母、粉紅擲孢酵母、深紅酵母等酵母［5］及煙曲霉［6］、青霉［7］等霉菌。塑料袋發(fā)酵玉米霉變后煙紅曲霉菌增多，這可能與霉變初期主要為酵母發(fā)揮作用、霉變后期主要為霉菌發(fā)揮作用有關(guān)［8］。添加外源菌后全株玉米中減少了釀酒酵母，可能原因?yàn)槿樗峋?］或乳酸等有機(jī)酸［10，11］殺滅了釀酒酵母，這和本試驗(yàn)添加外源菌后pH降低的結(jié)果相一致。

目前未見塑料袋發(fā)酵全株玉米霉變效應(yīng)和加菌效應(yīng)關(guān)于乳酸菌及酵母的報(bào)道。本試驗(yàn)中添加外源菌增加了未霉變玉米中乳酸菌含量的結(jié)果，與青貯結(jié)果［11，12］一致。本試驗(yàn)中霉變及添加外源菌皆降低霉變玉米中乳酸菌的含量、增加酵母的含量，且二者互作顯著，推測(cè)其主要原因可能為乳酸菌被耐酸性的酵母利用［9，11］，也可能與乳酸菌自身厭氧且中間多次取樣導(dǎo)致乳酸菌衰減有關(guān)［13］。乳酸菌和酵母之間的關(guān)系有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

全株玉米霉變，表面看是霉菌作用的結(jié)果，實(shí)質(zhì)仍是自由基代謝紊亂的結(jié)果［14，15］。正常情況下自由基的產(chǎn)生與清除保持平衡，當(dāng)該平衡被破壞時(shí)飼料或食物變質(zhì)。本試驗(yàn)中全株玉米霉變，即升高了羥自由基、丙二醛的含量，也升高清除劑過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶的含量，但總抗氧化能力降低，表明自由基相對(duì)過(guò)量產(chǎn)生，這與自由基紊亂導(dǎo)致食物變質(zhì)、疾病病變的常規(guī)一致［16］。本試驗(yàn)中添加外源菌降低了霉菌全株玉米總抗氧化能力的結(jié)果與外源菌降低霉變玉米中乳酸菌含量的結(jié)果相一致，推測(cè)總抗氧化能力降低與乳酸菌含量降低有關(guān)。

自由基的產(chǎn)生及清除與電子轉(zhuǎn)移有關(guān)。檸檬酸合成酶、乳酸脫氫酶及NADH氧化酶皆是糖酵解中的關(guān)鍵酶，其中乳酸脫氫酶主要作用是催化乳酸氧化為丙酮酸，將氫轉(zhuǎn)移給NAD變成為NADH；NADH氧化酶催化NADH氧化為NAD+，同時(shí)將O2還原為H2O或H2O2。目前未見霉變效應(yīng)及加菌效應(yīng)關(guān)于乳酸脫氫酶及NADH氧化酶的報(bào)道。本試驗(yàn)霉變降低全株玉米乳酸脫氫酶及升高NADH氧化酶的活性，應(yīng)與H+與O2-有關(guān)，這與霉變導(dǎo)致羥自由基、丙二醛升高的試驗(yàn)結(jié)果相一致。外源菌降低乳酸脫氫酶及升高NADH氧化酶的活性，其機(jī)理不清，但該結(jié)果與外源菌降低過(guò)氧化物酶及總抗氧化能力的結(jié)果相一致——由于乳酸脫氫酶及NADH氧化酶廣泛存在于乳酸菌［17，18］中，推測(cè)其影響機(jī)理可能與乳酸菌被耐酸性的酵母利用［9，11］有關(guān)。由于添加的外源菌中除乳酸菌外還含有枯草芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌對(duì)霉變的影響有待深入研究。